定量检查法标准操作规范2006.12.12.ppt

细菌内毒素定量检查法 天津大学药品生物制品 检测技术研究开发中心 易泰实验室 第一部分 细菌内毒素定量检查法基础知识 一.细菌内毒素标准品 二.鲎试剂（TAL） 三.细菌内毒素检查用水 一.细菌内毒素标准品 细菌内毒素国家标准品（RSE ）： 批号： 981 效价：9000 单位： EU 细菌内毒素工作标准品（CSE ）： 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。 细菌内毒素化学结构(脂多糖LPS)： 1.O-特异性多糖链(亲水端) 2.核心多糖 3.类脂A（生理活性中心）(疏水端) 细菌内毒素在水溶液中的状态： ！2000版和2005版中国药典在“细菌内毒素”检查法中都注明：细菌内毒素溶液要混旋15min和30s。 二.鲎试剂（TAL） 鲎试剂定义(部颁标准):鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品. 细菌内毒素和鲎试剂生化反应原理： 细菌内毒素（脂多糖LPS） 1,3-(d,β)-葡聚糖 C因子 C+ B因子 B+ G+ G 凝固酶原 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） 三.细菌内毒素检查用水 1.药典规定： 凝胶法： 0.015Eu/ml 定量法： 0.005Eu/ml 2.注意:要使用和鲎试剂同一厂家的检查用水 第二部分 细菌内毒素定量检查法标准操作规范 一 .标准曲线制作 二 .样品检测 1. 干扰预实验(回收率实验) 2. 日常检测 一.标准曲线制作 1.溶解细菌内毒素工作标准品 2.稀释细菌内毒素工作标准品 3.溶解、分装鲎试剂 4.加样 5.生成标准曲线 1.溶解细菌内毒素工作标准品 取效价为100EU的内毒素工作标准品1支（工作标准品为中国药品生物制品检定所研制、标定、分发），开启，加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，然后用封口膜封闭瓶口，在混旋器上混合15分钟，混旋后得到100EU/ml的内毒素工作标准品溶液。 2.稀释细菌内毒素工作标准品 等比例稀释内毒素标准品浓度溶液，每一步稀释前要充分振荡30秒后再进行下一步稀释。 例：把浓度为100EU/ml的工作品稀释为10，1，0.1，0.01EU/ml四个浓度，可按下图稀释： 100EU/ml 10EU/ml 1EU/ml 0.1EU/ml 0.01EU/ml 3.溶解、分装鲎试剂 取2支鲎试剂（装量为0.6ml），分别加入0.6ml细菌内毒素检查用水，静置，待其充分溶解后，将它们混合在一支内混匀、待用。取10支仪器定量专用小试管，按2支1组放于试管架上，分别加入0.1ml鲎试剂（注意不要产生气泡）。 4.加样 取稀释好的四个内毒素溶液10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml、0.01EU/ml0.2ml分别加入含有鲎试剂的小试管中，每个点2个平行管，注意加样前应混旋内毒素溶液30秒，且每个溶液应更换加样头。取细菌内毒素检查用水0.2ml加入含有鲎试剂的小试管中，做2个平行管，作为阴性对照。每个浓度在加完样后应立即用封口膜封口，放入测定仪中，开始检测。 5.生成标准曲线 到达一定时间后，用鼠标点击细菌内毒素软件，则计算机对数据进行计算，自动生成标准曲线。 标准曲线的一些注解说明： 1.标准曲线成立的条件: a.符合药典规定：n ≥ 3 平行管≥ 2 b.相关系数 IrI ≥ 0.98 c.平行管间的变异系数要小于10%(建议值) d.阴性对照管的内毒素反应时间要大于标准曲线的最低浓度的反应时间 阴性对照管的含义： 是否有外来内毒素影响标准曲线实验。 1.细菌内毒素检查用水 2.实验器材 3.环境 4.操作过程 2.标准曲线更改的条件：