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编码旋毛虫31kDa抗原DNA疫苗构建及其诱导的免疫应答 研究生 张红卫 导师 崔晶王中金 郑州大学基础医学院寄生虫学教研室，河南省分子医学重点学科开放实验室 郑州450052 摘 要 旋毛虫(Trichinella 分布，被认为是出现或再次出现的疾病。目前此病在全世界约有1100万人体感染者． 报道在1998年有10000多头生猪感染。在前苏联及东欧国家。由于社会制度的变化、 经济或战争的原因导致国营养猪场的解散和政府兽医部门控制措施不力，结果引起家猪 旋毛虫感染率的明显升高，如在俄罗斯的某些村庄猪旋毛虫的感染率达50％。在罗马尼 亚猪的旋毛虫感染率为O．01％～1．4％，平均为0．158％。近年来在全国17个省、直辖市、 自治区己发现人体旋毛虫病病例并已发生多起本病暴发流行。河南省为我国旋毛虫病的 高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发，400人发病。本病若不及时诊断和治疗，患者 的死亡率可高达3％～30％。我国人体旋毛虫病的增加与猪旋毛虫感染率的增加密切相 旋毛虫感染率仅分别为O．44％和0．86％。因此．目前在我国急需开展旋毛虫痫的预防和 控制工作，而采取各种措施降低动物旋毛虫的感染率特别是猪的感染率是预防和控制旋 毛虫病的关键措施之一。各种旋毛虫病疫苗的开发和使用是非常重要的，对猪接种后可 达到有效的的减虫率和保护率，从而减少养猪业经济损失，消灭人体旋毛虫病的传染 源，继而可控制人体旋毛虫病的流行。 国内外学者对旋毛虫病的免疫预防进行了大量的研究工作，作为第一代疫苗，死疫 苗和减毒活疫苗对感染旋毛虫的动物具有部分保护作用，但所用的抗原多为旋毛虫粗抗 原，如虫体抗原、可溶性抗原及组分抗原等。因抗原组分非常复杂．往往难以取得理想 的免疫预防效果且极不稳定，此外，由于旋毛虫的体外连续培养未取得成功，不能获取 足够的抗原用于大规模防治旋毛虫病。 随着分子生物学技术的迅速发展，利用基因工程技术在体外大量表达旋毛虫抗原已 成为可能，利用基因工程技术生产的重组亚单位疫苗解决了天然虫体抗原来源的困难， 但基因工程重组蛋白多为融合蛋白、存在有后续分离困难和不具有天然蛋白的分子构象 的缺点。1992年首先报道的DNA疫苗可诱导产生针对多种病毒、细菌和寄生虫抗原的 免疫应答，还可以对肿瘤产生有效的治疗。DNA疫苗诱导产生广泛的免疫反应，包括 抗体、T辅助细胞和CTL细胞免疫反应。实验研究证实对利什曼原虫、弓形虫、血吸虫、 疟疾、锥虫等寄生虫感染有较好的保护作用，为旋毛虫病疫苗的研究带来了新的希望。 近几年一些研究者研究了旋毛虫的抗原分子。Arasu等克隆了旋毛虫的一个cDNA基因 击感染。我们曾利用基因工程技术将编码旋毛虫31kDa抗原的基因克隆到原核表达载 blot证实表达的重组蛋 体pGEMEX．1中，并在大肠杆菌中表达出了融合蛋白，Western 白具有较好的反应原性，对于旋毛虫病的免疫预防具有潜在的应用价值。因此，本研究 应用基因工程技术构建编码旋毛虫31kDa抗原基因的重组真核表达质粒，接种动物后 观察在体内的表达情况。旋毛虫DNA疫苗的研究将为旋毛虫病的免疫预防开创一种新 方法，对控制旋毛虫病的流荦亍具有重要意义。 材料和方法 本实验用冒蛋白酶消化法收集旋毛虫肌幼虫，通过RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫中 获得编码旋毛虫肌幼虫3lkDa蛋白的目的基因片段，克隆到pucl8载体，通过核酸内 I和Hind 切酶BamH III双酶切、EcoRI单酶切和用特异性引物进行PCR鉴定阳性克隆 插入目的基因片段大小的正确性。然后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3的 BamH I和Hind IIl位点中，构建重组质粒Ts3 I／pcDNA3。经核酸序列测定证实插入片段 的正确性。登陆国际NCBIGenBank数据库进行核酸序列同源性和编码蛋白质相似性比 较。将编码旋毛虫肌幼虫31kDa蛋白的DNA疫苗用基因枪注射昆明小鼠，将其注射部位 的皮肤组织用感染旋毛虫小鼠的阳性血清经免疫组化检测重组蛋自的表达；用基因枪和 在