丙型肝炎病毒聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化和结构研究.pdfVIP

丙型肝炎病毒聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化和结构研究 杨振‘ 蒋建东2祁自柏1陈鸿珊2 张华远1 李河民1 (1中国药品生物品检定所100050；2．中国医学科学院医药生物技术所100050) 【摘要】目的构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后，研究获得高效表达聚合酶蛋白的最适条件，同 时摸索表达产物的纯化方法以及晟佳变性和复性条件，为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选可能药 HCVNS5b 法进行验证。同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究。对该酶相关的分子生物学参数和二级结构进行分析。 结果测序及凄码框架分析结果表明得到相关HCVNSSbRNA聚合酶全基因序列，在最佳表达条件下，诱导表达融 合蛋白(65kDa)，其最高表达量为189％。得到r纯度大于92．83％的酶蛋白，用WB法检测样品，能与HCVNS5b单 抗反应，证明其为NSSb蛋白．并保持活性。对其二级结构的分析表明，我们获得活性集团完整的HCV聚合酶。结 论HCV聚合酶的高效表达和纯化，为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选可能药物奠定基础。 f关麓词】 丙型肝炎病毒聚合酶融合蛋白 原核表达层析结构 丙型肝炎病毒(HCV)是慢性和散发性非甲非乙 型肝炎的主要病原体，世界范围内感染率约为3％。 中国医学科学院医药生物技术所尚广东博士提供。 HCV引起的炎40％～60％发展为慢性，其中25％最2．方法 终发展为肝癌。迄今为止仅限于n一干扰素及利巴韦 2．1 HCVRNA的提取…及基因序列的扩增 林，有效率低。因此，迫切需要寻找有效的治疗和预 取血清样本用异硫氰酸胍法提取的RNA，用于 防措施。HCV聚合酶具有RdRp活性，是HCV复制 的关键酶，是抗HCV药物研究的理想靶位。本研究 高保真P 目的足构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒， 增时碱基错配。 并获得高效表达，同时摸索表达产物的纯化以及变 2．2 PCR产物的克隆及测序 性和复性条件．为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶 PCR产物用玻璃奶法纯化，将纯化的 复制模型及筛选可能药物创造条件。 经酶切及测序和读码框架鉴定得到连接方向正确的 材料与方法 阳性克隆。 1．材料 2 3目的基因片段最佳表达条件的选择和表 血清样本：用于HCVRNA的提取，河南洛阳血 达蛋白存在形式的研究 站献血员血清，由河南华美生物公司提供，是该公司 将上述经过确证的阳性克隆进行小量诱导表 HCVRNA106拷贝／ml内部参考血清。 达，挑选高表达菌株用于大量诱导表达。分别转接 主要试剂：％s、酵母粉和胰蛋白胨，琼脂糖、 SDS、甘氨酸、EB、氨苄青霉素、IPm，D1Tr、卡那霉素。 pfuDNA聚合酶，T40NA连接酶为promega公司分析 纯产品；甘油、尿素为国产分析纯试剂。玻璃奶为原 平皓公司产品；溶菌酶为华美生物公司产品；PCR 小时。收集上清及重悬的沉淀SDS聚丙烯酰胺凝 胶电泳检验。 Marker为Promega公司及大连宝生物产品；各种限制 性内切酶为大连宝生物产品，中分子量标准蛋白为 2．4 目的基因片段表达产物的纯化 中科院上海生化研究所产品。 2．4．1包涵体的变性溶解及融合蛋白的初步 提纯 质粒与菌株：①pET-30a。为NOVAGEN公司 (TB0559thEdition05／00)产品，大肠杆菌BL21(DE3)，将沉淀溶于20mM尿素．40c，2小时，4℃，l0009 中国预防医学科学院病毒所毕胜利教授提供。② 离心20分钟，取上清。沉淀中若仍有透明末溶解物 ·154· 质，再用8M尿素溶解，离心，弃沉淀。将变性溶解 的蛋白，经O．22btM滤