酵母人工染色体克隆技术及其进展.pdfVIP

… 一 … 蛐 … ·249 · 酵母人工染色体克隆技术及其进展 盥 塑 (中国医学科学院基础医学研究所 ．北京 100005) 7 提 要 酵母人I染色体克隆 (YAC)是最近几年发展起来的大分子DNA 克隆技术 文 章综述 7YAC克隆技术的发展 ，YAC的分离、分析与鉴定，以及这一技术在分子 生转学 中的应用． 关键词 基因克隆， ，染色体制圈 _●— ’1—f—+— 常规的克隆方法应用质粒或噬菌体为载 体，细菌为宿主细胞，克隆插入片段小于50kb． 由于真核细胞基因功能区域常跨越几百kb，在 定向克隆中目的基因距起点通常为几千kb，人 们希望能找到大片段DNA克隆技术，跳跃文 库叫、Pl噬菌体克 隆[、酵母人工 染色体 (YAC)克隆口等就是在这一 目的上发展起来 的新的克隆技术． YAC (yeastartifieialchromoeome)的基 本原理是在体外构建含酵母着丝粒与端粒的链 状大分子DNA，将其转化入酵母细胞，并在酵 母中以染色体形式稳定存在．载体由二条臂组 圈 1 YAC宽隆示童田 成 ，含DNA复制子 ，酵母着丝粒，可选择标记 载体 (pYAC2)吉Tetrahymena端粒 (TEL)．酵母着丝粒 及Tetrahymena的端粒 ，克隆片段插入于两臂 (CEN4)，自主复制序剜 (ARSI)，克隆位点 (SmaI)及 之间 (图1)．实验证明可将 lO0--1000kb的外 选择标志 (TRP1与URA3) 源DNA分子制备成YAc，并在酵母中以染色 1 克隆方法的改进 体形式稳定繁殖、这一技术填补了连锁分析得 到的遗传图谱与重组DNA技术得到的分子物 1．1 大分子 DNA制备 由于YAC转化酵母细胞的效率很低，建 理图谱之间的差距，相互重叠的YAc克隆代 立 YAC文库需要大量大分子DNA (1000 表某一染色体 区域 的连续 DNA序列；每个 kb)．最初应用蔗糖梯度离心法分离制备酵母 YAC则可能通过次级克隆而进行序列分析．因 染色体DNA及从白细胞中制备哺乳动物染色 此 YAc克隆技术为基因结构与功能的研究及 体 DNA口“]，但所得 DNA很稠并易受机械损 应用反 向遗传学分离致病基因提供了有效手 段．本文综述YAc技术及其必威体育精装版进展． 收稿 日期 -1992—0406 修 回日期 ；1992—06—25 ·250 · 生物化学与生物物理进展 1993年 第 20卷 第 4期 伤，操作时也不精确．应用凝胶包埋法制备染 可 利用 T7或 T3RNA 聚台酶 从酵母 细 胞 色体 DNA得到DNA片段大干 4000kb，不易 DNA 中直接制备 YAC插