第三章半薄与超薄切片解读.ppt

第三章 超薄切片与半薄切片 第一节 超薄切片 专用于透射电子显微镜标本的制备 透射电镜 透射电镜是观察细胞及亚细胞结构的重要手段：我们所获得的关于细胞、细胞器、细胞内大分子的形态信息大多由它提供 透射电镜的样品制备中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。 高尔基体 Chloroplast of tobacco:1 = cell wall2 = cytoplasm3 = vacuole4 = chloroplast envelope 叶绿体被膜5 = tonoplast液泡膜6 = plasma membrane质膜7 = grana叶绿体基粒 8 = stroma thylakoids类囊体9 = starch grains淀粉粒10 = stroma基质 叶绿体 内质网 线粒体 酶体 超薄切片 植物细胞的大小 直径多为25-50um之间。 最小：球菌直径0.5um。 最大：苎麻纤维细胞长550mm。 超薄切片厚度是50-70nm 1细胞=350-1000张切片 透射电镜样品制备中，由于透射电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。 切片厚度:50-70nm 制作程序与石蜡切片相似,只是包埋剂不同(环氧树脂),切片方法不同 超薄切片制作程序 一. 取材的基本要求 为保持细胞结构的生前状态, 必须做到快、小、准、冷 (1)快:最短时间内(争取在1min内)投入固定液。(2)小:体积要小(一般不超过1mm×1mm×1mm)。 固定剂的渗透能力较弱；如果块大，内部不能得到良好的固定。(3)准:取材部位要准确。(4)冷:低温(0℃～4℃)操作,以降低酶的活性,防止细胞自溶。 与石蜡切片相似, 经取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。 二.固定 1. 固定剂 四氧化锇: 对多细胞结构蛋白, 脂肪, 脂蛋白的固定效果好。有强烈的电子染色作用, 固定样品图象反差较好。 戊 二 醛: 穿透力比四氧化锇强. 糖原、微管、核蛋白的固定效果比锇酸好. 对脂类的保存能力很差, 没有电子染色作用。 电子染色原理 某些重金属盐（铀、铅等）与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附, 重金属的原子对电子束形成散射, 从而提高图象的反差。 拟南介小孢子母细胞 二.固定 2. 固定方法: 戊二醛—锇酸双重固定法 分预固定和后固定,中间用磷酸缓冲液漂洗. 这样可以相互补充,使细胞的细微结构得到很好的保存。 步骤: 前固定用2.5%戊二醛固定2小时、后固定用1%锇酸固定1～ 2小时，脱水。缓冲液漂洗20min 三. 脱水常用脱水剂: 乙醇、丙酮 梯度脱水 四.过渡 环氧丙烷:相当于石蜡切片中的透明剂二甲苯。 五.浸透和包埋 (一) 浸透 利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂。 步骤:环氧树脂+无水乙醇(1:1)中12小时→环氧树脂24小时 (二) 包埋剂 环氧树脂:高分子聚合物,单体状态时(聚合前)为液体、能够渗 入组织内;当加入硬化剂和经加温后,聚合成固体 包埋剂: 环氧树脂 硬化剂: 酸酐类,与环氧树脂起交联作用,并被吸收到树脂链中 十二烷基琥珀酸酐(DDSA), 六甲酸酐(MNA), 顺丁烯二酸酐 加速剂: 引起环氧树脂末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状 聚合物,加速包埋剂的凝固速度。 2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺 增塑剂: 使包埋块具有适当的韧性，改善包埋块的切割性能。 邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP) 环氧树脂包埋剂的配方 包埋步骤 1.组织块包埋在环氧树脂包埋模板中， 2.置烤箱烘干， 3.经45℃(12小时)、60℃(36小时)后，即可聚合硬化， 形成包埋块。 包埋操作中注意事项 (1)干燥: 所有试剂要防潮, 所用器皿应烘干； (2)搅拌: 配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； (3)包埋时动作轻巧，防止产生气泡； (4)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎； 药用胶囊：最好用1号(直径6. 3mm)或2号(直径5. 6mm) 包埋步骤: a. 取载玻片硬纸盒作为支架，用打孔器在纸盒的盖上钻若干排孔，孔的直径比胶囊略小。 b. 然后将胶囊插入孔内，胶囊的底部悬空。 c. 打开胶囊盖子，用滴管将包埋剂加入胶囊内至3/4的位置，然后小心地将材料连同少许包埋混合液移入胶囊内，待材料下沉到胶囊底部后，用一只细的清洁铜丝调整材料的方位，盖上胶囊盖。 d. 但在加盖之前，必须把盖的圆顶端压凹，这样可以避免空气停留在盖的顶端，因为氧气会阻碍环氧树脂凝固。 e. 最后将