《园艺植物生物技术》第六章 基因分离与克隆.ppt

第二节 基因克隆操作 意义 基因克隆常用工具 PCR 基因文库构建 基因的筛选与鉴定 一、基因分离的意义 特有基因：生物进化，木本果树与草本植物不同，更复杂；目的不同，果树以生产果实为目的；多年生，控制更复杂，影响因素也更多。 通过分离的基因，对生理现象遗传控制的分子机理进行研究，这是无法以拟南芥代替的。例如，果树童期分子机理的研究。 互相促进，相辅相承。 2. 基因分离的工具 二、基因分离常用工具 ①限制性内切核酸酶 ②连接酶 ③聚合酶 ④载体 ⑤受体细胞 ③聚合酶 催化DNA的合成 E.coli DNA聚合酶I: 聚合和外切活性 用来切口平移标记，末端标记 Klenow DNA聚合酶：补平3’凹端，抹平3’凸端，随机引物标记。 耐热DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，pfuDNA聚合酶。 反转录酶：AMV, MMuLV T4/T7噬菌体DNA聚合酶 载体类型 A. 质粒载体 B. 噬菌体载体 C. 粘粒载体 D. BAC/YAC载体 E. 其他 质 粒 标记基因 抗生素基因：四环素抗性基因 Tetracycline 氯霉素抗性基因Chloramphenical 卡那霉素抗性 Kanamycin 新霉素抗性 Neomycin 氨苄青霉素 Ampicillin 其他 质粒 转录载体 噬菌体载体：置换型载体 噬菌体载体 主要用于构建基因文库，特别是cDNA文库 主要步骤有①载体纯化；②载体与外源DNA的酶切；③连接；④重组噬菌体的体外包装；⑤感染；⑥筛选 粘粒载体 Cosmid 质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒，cos序列是噬菌体DNA中的一段序列。 大小一般 5-7kb, 用来克隆35-45kb大小的片段 BAC/YAC载体 细菌人工染色体 Bacterial Aritificial Chromosome 酵母人工染色体 Yeast 操作比较困难，主要用于大片段DNA； 如基因组文库 受体类型 原核：大肠杆菌，枯草杆菌，链霉菌，蓝藻等 真核：真菌： 酵母、构巢曲霉； 植物：原生质体、细胞、组织、器官 动物：昆虫细胞、卵母细胞等 分离基因用简单易于操作的受体；用于遗传信息的表达和功能研究则用真核生物受体细胞。 DNA向宿主细胞的导入方法 CaCl2法：感受态细胞与质粒DNA 热击法 42 C 电击法 基因枪法 病毒侵染 其他 三、聚合酶链式反应（ PCR ） 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。 PCR技术实际上实在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；? ②退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；? ③延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。? 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 标准的PCR反应体系 ? 10×扩增缓冲液 　 ? 10 ul ? 4种dNTP混合物 　 各200 umol/L 引物 　　　　 　 ? ? 各10～100 pmol 模板DNA 　　　 　0.1～2 ug Taq DNA聚合酶 　 ?2.5 u Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L 加双蒸水至 　 ?100 ul 四、基因文库 基因文库(gene library)则是指某一生物类型全部基因的集合，这种集合以重组形式出现。某生物DNA片段群体（对于核DNA是以限制性酶切后的群体）与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养