遺传性疾病的分子诊断.pptVIP

遗传性疾病的分子诊断 上海第二医科大学附属瑞金医院 樊绮诗 ——诊断策略和工具 用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。1976年人们开始在实验室进行研究，1984年以来，基因检测在许多国家已成为常规项目，主要用于遗传性疾病的诊断。 一、遗传性疾病的分类 常染色体连锁遗传性疾病 ——致病基因位于常染色体 性染色体连锁遗传性疾病 ——致病基因位于性染色体 常染色体连锁遗传性疾病 常染色体隐性遗传——位于一对常染色体上的两个等位基因均发生突变才能产生临床症状，此时所导致的相应疾病即为常染色体连锁隐性遗传性疾病。 同一对染色体中只有一个等位基因发生突变的个体称为杂合子，二个等位基因均发生突变的个体称为纯合子。 囊性纤维变：常染色体连锁隐性遗传(7q31) 常染色体连锁显性遗传——位于一对常染色体上的二个等位基因之一发生突变即产生临床症状，所导致的相应疾病即为常染色体连锁显性遗传性疾病。 特点：家系中患者数目较多，大多情况下每一代均有患者。 Huntington舞蹈症：常染色体显性遗传(4p16.3) 性染色体连锁遗传性疾病 X染色体连锁遗传：大多为隐性 (如甲型血友病、杜氏肌营养不良症)，显性遗传非常罕见。 Y染色体连锁遗传 二、遗传性疾病中常见的分子异常 遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常所致。 基因突变主要包括三大类，即点突变、片段性突变和动态性突变。 （一）点突变 点突变：DNA分子中单个碱基的替换 终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长。 错义突变、无义突变、移码突变 各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变、蛋白质合成量下降、无蛋白质合成。 （二）片段性突变 核苷酸的丢失和增多 缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失 插入：外来基因片段插入某一基因序列中 倍增：基因内部某一段序列发生重复 基因重排：基因组中原来不在一起的基因 由于某些原因组合排列在一起。 （三）动态性突变 以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。 脆性X综合征：CGG重复 少年脊髓型共济失调：GAA重复 …… 三、遗传性疾病基因诊断的策略 （一）直接诊断策略 基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。 直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。 （二）间接诊断策略 间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。 间接诊断不是寻找 DNA 的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。 四、基因诊断所采用的技术 (一) 直接诊断所采用的技术 DNA片段性突变的检测 （1）Southern 印迹技术 将基因组DNA用限制性酶水解成无数片段经凝胶电泳后用碱处理使凝胶中的DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记探针与变性单链杂交，可使特异条带显影。 （2）多重PCR技术 在一个PCR反应体系中放入多对引物，当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。 2. 点突变 （1） 已知点突变的检测方法 a）PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。 b）等位基因特异性寡核苷酸杂交 被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为15~20bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降 5~7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。 C）PCR-ELISA 将PCR产物用ELISA方法加以