动物细胞培养基本技术选编.ppt

细胞培养基本技术;细胞培养的甚本概念;细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫;原代培养细胞的生命归宿; 有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain ;培养细胞的分类; 上皮样细胞型 ;生长特点;成纤维细胞样细胞 ;生长特点;培养细胞的特性; 每代贴附生长细胞的生长过程;游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时;贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子???吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） ; ;潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一 般为6～24小时。;对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 ;停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 ;密度抑制（Density inhibition）或接触抑制（Ccontact inhibition）;培养细胞生长的条件;基本操作技术和要求;微生物污染的途径;微生物污染的检测;微生物污染的防治;微生物污染的防治;细胞交叉污染 ;培养室内的无菌技术; 实验准备; 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 ;超净台;滤 器; CO2培养箱;自动双重纯水蒸馏器 纯水仪;酶标仪 微孔板震荡器;培 养 板; 培养瓶; 常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 ;清洁液的配制;新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗;0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗;自来水煮沸2次,每次15分钟;蒸馏水煮沸20分钟，50度烤干备用。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水中过夜，用纱布或棉签和50度清洗液刷洗，浸于清洁液中15分钟，流水冲洗（15－20遍),蒸馏水浸洗三次，双蒸水中泡24小时，晾干备用。 ;2 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml;消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 ;培养基;合成培养基; 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 ;血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等