液相色谱仪测氨基酸.pdf

高效液相色谱法测定氨基酸 一 实验目的 一 实验目的 了解氨基酸的高效液相色谱分离分析方法； 了解氨基酸的高效液相色谱分离分析方法； 学习高效液相色谱仪的使用方法。 学习高效液相色谱仪的使用方法。 二、方法原理 二、方法原理 蛋白质样品经酸或碱水解后再行用丹磺酰氯进行衍生 蛋白质样品经酸或碱水解后再行用丹磺酰氯进行衍生 化作用溶解于流动相溶液， 用具有C8反相柱荧光检 化作用溶解于流动相溶液， 用具有C8反相柱荧光检 测器的反相液相色谱进行测定，能很好地测定出各种 测器的反相液相色谱进行测定，能很好地测定出各种 氨基酸的含量。 氨基酸的含量。 三、仪器与试剂 三、仪器与试剂 （一）仪器： （一）仪器： 高效液相色谱仪仪。 高效液相色谱仪仪。 （二）试剂： （二）试剂： 乙腈（重蒸馏）； 乙腈（重蒸馏）； 丙酮（重蒸馏）； 丙酮（重蒸馏）； 丹磺酰氯丙酮溶液：称取1.0克丹磺酰氯溶于10毫升丙 丹磺酰氯丙酮溶液：称取1.0克丹磺酰氯溶于10毫升丙 酮中。使用时吸取0.1毫升此溶液用8毫升丙酮制备而 酮中。使用时吸取0.1毫升此溶液用8毫升丙酮制备而 成。贮存于冰箱中，工作液当天配制； 成。贮存于冰箱中，工作液当天配制； 缓冲溶液（pH=0.5 ）: 称取8.4 克碳酸氢钠溶解于 缓冲溶液（pH=0.5 ）: 称取8.4 克碳酸氢钠溶解于 1000毫升水中，用0.5mol/L氢氧化钠调节溶液pH值 1000毫升水中，用0.5mol/L氢氧化钠调节溶液pH值 为10.5，过滤后使用； 为10.5，过滤后使用； 0.5mol/L氢氧化钠溶液； 0.5mol/L氢氧化钠溶液； 0.01mol/L盐酸溶液及6mol/L盐酸溶液； 0.01mol/L盐酸溶液及6mol/L盐酸溶液； 6mol/L氢氧化钡溶液； 6mol/L氢氧化钡溶液； 醋酸； 醋酸； 磷酸； 磷酸； 氨基酸标准混合溶液：用0.01mol/L盐酸溶液制备成 氨基酸标准混合溶液：用0.01mol/L盐酸溶液制备成 每毫升含20 每毫升含20 微克的各种氨基酸的标准混合溶液； 微克的各种氨基酸的标准混合溶液； 内标溶液：用0.01mol/L盐酸把正亮氨酸制备成每 内标溶液：用0.01mol/L盐酸把正亮氨酸制备成每 毫升20微克的内标准溶液； 毫升20微克的内标准溶液； 流动相溶液： 流动相溶液： 甲：每100毫升乙腈中含有0.1毫升醋酸和0.77毫升的磷 甲：每100毫升乙腈中含有0.1毫升醋酸和0.77毫升的磷 酸； 酸； 乙：称取8.1克醋酸钠，用水配制成1升后，加入0.1毫 乙：称取8.1克醋酸钠，用水配制成1升后，加入0.1毫 升醋酸，然后用磷酸调节至pH=3 。 升醋酸，然后用磷酸调节至pH=3 。 所用制备溶液的去离子水均需重新过滤一次。 所用制备溶液的去离子水均需重新过滤一次。 四、分析步骤 四、分析步骤 1、样品处理与测定 1、样品处理与测定 （1 ）蛋白质的水解：称取1毫克的蛋白质样品或相 （1 ）蛋白质的水解：称取1毫克的蛋白质样品或相 当于1毫克蛋白质的样品于玻璃管中，加入1毫升 当于1毫克蛋白质的样品于玻璃管中，加入1毫升 6mol/L盐酸后用磨口封口或烧结封口，移入 6mol/L盐酸后用磨口封口或烧结封口，移入 110℃恒温箱中加热16小时，取出冷却。用微量注 110℃恒温箱中加热16小时，取出冷却。用微量注 射器取20微升水解样液于小玻璃管中，加入10微 射器取20微升水解样液于小玻璃管中，加入10微 升正亮氨酸作为内标溶液，并在水浴中蒸发干 升正亮氨酸作为内标溶液，并在水浴中蒸发干 燥。 燥。 （2 ）衍生物制备及其测定：将上述干燥制备的样 （2 ）衍生物制备及其测定：将上述干燥制备的样 品加入40微升pH=10.5 缓冲溶液，接着加入100 品加入40微升pH=10.5 缓冲溶液，接着加入100 微升丹磺酰氯工作试剂，紧密封住管口，充分 微升丹