HRP酵素分析方法及各种变因对于HRP活性之影响1实验.PDF

第三章 HRP 酵素分析方法及各種變因對於 HRP 活性之影響 3- 1 實驗目的 在酵素固定化中 ，測量固定化後單位面積基材上的酵素量及其殘餘活性為判 斷酵素固定化成效最重要的兩項指標 。因此本章節主要目標為建立 HRP 定量分 析及活性分析步驟 ，以方便分析電極片上 ，酵素固定化之效果 ，並探討溶液 pH 值 、溫度 、交聯劑濃度與緩衝溶液的種類等變因對 HRP 活性之影響 。藉此確認 HRP 在進行交聯反應時 ，各變因的優化條件為何 ，以利往後尋找酵素固定化的 最佳條件 。 本章 3-2 節為簡介相關實驗的原理及步驟 ，而 3-3 節則為實驗結果與討論 。 3-2 實驗步驟 3-2- 1 HRP 定量分析 由於HRP 也是一種蛋白質 ，因此常見的蛋白質定量分析 ，皆適用於 HRP 定 量分析。大致而言 ，常見的蛋白質定量分析 ，分為成色比色法(colorimetric methods) 及分光光度法(spectroscopic methods)兩大類 。成色比色法(colorimetric methods) 的基本原理為 ，利用特定離子或是染劑跟蛋白質結合後 ，發生顏色變化 ，以分光 光度儀測量溶液吸收值的改變 ，且吸收值的變化幅度與蛋白質濃度成正比 ，藉此 確認溶液中蛋白質的含量 ；其中又以 Biuret assay 、Lowry assay 和 Bradford assay 最為常見 【23】。下面將簡介此三種分析方法的原理 。 Biuret assay 為利用銅離子於鹼性環境中 ，會與蛋白質中的碳醯基(carbonyl groups)結合之特性 ，形成紫色的複合物 ，此複合物通過兩個碳醯基(carbonyl groups)與一個銅離子結合而成 ，且在波長 540nm 下 ，具有特定的吸收值 。由於 對於單一種類的蛋白質而言 ，其碳醯基(carbonyl groups)的數目會與蛋白質的含 量呈正比 ，而碳醯基(carbonyl groups)的數目又與複合物的含量呈正比 ，因此可 藉由測量複合物之吸收值 ，決定溶液中蛋白質之含量 。此法偵測蛋白質濃度之常 22 見範圍為 0.5 到 80mg/ml ，並不受蛋白質種類之影響 ，但檢測蛋白質量時 ，會受 若干種化學物質干擾 ，如 ：硫酸銨及 Tris 等 【22, 24 】。 Lowry assay 為 Biuret assay 之延伸 ，當銅離子與碳醯基(carbonyl groups)作用 後 ，還可再與 Folin-Ciocalteaug 試劑的 phosphomolybdic -phosphotungstate 作用 ， 形成藍色產物 ，且在波長 540nm 或是 750nm 下 ，具有特定的吸收值 。此法優點 為靈敏度高 ，偵測蛋白質濃度之常見範圍為 1 到 300µg/ml ，缺點為實驗步驟較 為繁複 ，且偵測蛋白質時 ，極易受其他化學物質影響 【22, 23】。 而目前被廣泛使用的方法為 Bradford assay ，此方法為在蛋白質溶液中 ，添 加一種酸性染劑(acidic dye)-Coomassie Brilliant Blue G-250 ，此染劑會與蛋白質 中 ，鹼性及芳香族胺基酸(basic and aromatic amino acids)結合 ，使染劑顏色從褐 色變成藍色的產物 ，而染劑之特徵波峰也會從波長 465nm 轉變成 595nm 。且在 一定蛋白質的濃度範圍內 ，產物於波長 595nm 下的吸收值 ，與產物的含量呈正 比 。由於產物的產量又與蛋白質的含量成正比 ，因此可藉由測量溶液於波長 595nm 下的吸收值 ，決定溶液中蛋白質的含量 。此法偵測蛋白質濃度之常見範圍 為 200 到 1400µg/ml 。若應用於微量分析(microassay)時 ，可偵測到數十個 µg/ml 。 此法最大優點為 ，檢測時不受常用緩衝試劑中的離子所干擾 【22, 23】。 而另一大類 ，常被使用的分光光度法(spectroscopic methods) ，其分析方式並 不藉由外加試劑使蛋白質顯色 ，而是藉由蛋白質本身之特定組成 ，於特定波長下 具有特定的吸收值 ，來達到蛋白質定量的目的 。如一般蛋白質中 ，常見的兩種芳 香族胺基酸(aromati