总RNA提取的原理、步骤.doc

总RNA提取的原理、步骤 ? 1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿 一步法） TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 ? 2.简易步骤 细胞或组织，加入0.4ml TRIZOL试剂后匀浆 ↓ 室温静置5分钟 ↓ 加入1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀 ↓ 室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟 ↓ 将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀 ↓ 室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清 ↓ 向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟 ↓ 弃上清保留沉淀，干燥 ↓ 沉淀物溶解于11μl的DEPC处理水中 ↓ 注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。 注意事项 ①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 ②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。 ③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5?M?NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 ④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在15?-30°C的条件下完成，试剂亦在15?-30°C的条件下。 ⑤75%乙醇(用DEPC处理过的水配制：将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01%?(v/v)。放置过夜并高压灭菌。) ⑥每50—100?mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 ⑦单层生长的细胞?直接往直径3.5?cm的培养板中加入1ml的TRIZOL溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIZOL量（每10?cm2加1?ml）。当TRIZOL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。 ⑧在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（RNA洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。 ? 逆转录cDNA及注意事项 如果cDNA当天不使用，则要保存在-20℃或-70℃。 ? RNA逆转录成cDNA操作流程简图如下：（在冰盒上操作） ? 1.将提取的RNA溶解于11 μl DEPC-t净化水中， 加入1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP轻微震荡后离心3-5秒。 2.在PCR扩增仪上70℃ 5分钟。 3.冰上冷却1分钟，并短暂离心，向反应体系中加入5×reaction buffer 4μl，RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/μl) 1μl，10 mM dNTP mix 2μl。 4.轻微震荡后离心3-5秒，在PCR扩增仪上37℃ 5分钟。 5.向反应体系中加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1μl，在PCR扩增仪上42℃ 60分钟进行逆转录，70℃ 10分钟灭活逆转录酶。 6.收集反应产物，冰上冷却