植物基因克隆的方法.ppt

* * 植物基因的克隆 基因 2. 基因克隆 3. 基因克隆的目标 基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序列。 基因克隆：利用体外重组技术，将特定基因 和其它DNA顺序插入到载体中。 克隆目标：识别、分离特异基因并获得基因 的完整全序列，确定染色体位， 阐明基因的生化功能，明确其对 特定性状的遗传控制关系。 植物基因克隆的方法 序列克隆 2. 依据序列同源性克隆基因 3. 人工合成并克隆基因 4. 表型克隆 5. 功能克隆 6. 定位克隆 7. 转座子标记法 方法一：根据已知基因的序列设计并合成一 对引物，从植物中提取DNA进行PCR扩 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的 载体上，用酶切和序列分析检测重子， 并与已知基因序列进行比较。 序列克隆 1.1 根据已知基因的序列 方法二： 在其它种属的同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因序列作为探针来筛选目的克隆。 例子：根据甜菜碱醛脱氢酶基因序列克隆 菠菜碱醛脱氢酶基因、自交不亲和 基因、花形态建成基因。 1.2根据DNA测序结果 方法一: 利用Adams等建立的表达序列标 记(EST)寻找新基因. 从组织或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆→5’端或3’端部分序列(EST,约400bp)测定→GeneBank/EMBL检索→检测所测序列或氨基酸序列与已知序列是否同源→发 现新基因 方法二: 利用Velculescu等建立的基因 表达 连续分析法(SAGE). ◆ 此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因. ◆ cDNA测序法只能分离特定时空下表达的基因,且不能分析基因内和基因间的调控序列,克隆出的新基因的功能也有待鉴定. 方法：根据已知的氨基酸或核苷酸序列，采 用植物偏爱的密码子，人工合成并克 隆该基因。（可对基因进行改造） 例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人工合 成并克隆了此肽的基因。 人工合成Bt基因。 人工合成并克隆基因 方法：利用植物的表型差异或组织器官特异 表达产生的差异来克隆植物基因。此方法试图把表型与基因结构或基因表达联系起来，从而分离特定表型相关基因。不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。 例子：利用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉 素合成酶基因。 表 型 克 隆（phonetypical cloning） 技术支持： 差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference analysis） 抑制性扣除杂交（suppression subtractive hybridization） 局限性： 表型克隆技术普遍存在着依赖于PCR技术、重复性较差、加阳性率高、对实验材料要求较高、材料间不能存在过多的差异，结果不便确证等缺点。 定义：根据性状的基本生化特性这一功能 信息，在鉴定和已知基因的功能后克隆. 方法：纯化相应的编码蛋白→ 构建cDNA 文库或基因组文库→筛选基因。 特点：用基因表达的产物蛋白质来克隆基 因. 功 能 克 隆（functional cloning） 1、将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，推测可 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文 库中筛选编码基因。 2、将相应的编码蛋白制成相应的抗体探针， 从文