实验八 蛋白质等电点测定和沉淀反应.pptVIP

实验八 蛋白质的等电点 测定和沉淀反应 一 蛋白质等电点的测定 一 蛋白质等电点的测定 在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白的等电点。 本实验借观察在不同PH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值得缓冲液。向诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的PH值即为酪蛋白的等电点。 一 蛋白质等电点的测定 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 二 蛋白质的沉淀及变性 三 思 考 题 四 甲醛滴定法(补充材料） 四 甲醛滴定法(补充材料） 四 甲醛滴定法(补充材料） 四 甲醛滴定法(补充材料） 四 甲醛滴定法(补充材料） * 生物化学实验 * （一）实 验 目 的 了解蛋白质的两性解离性质；学习测定蛋白质等电点的一种方法。 （二）实 验 原 理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。不同蛋白质各有其特异的等电点。 (三）操 作 方 法 混浊度 3．5 4．7 5．3 5．9 PH值 0.5 0.5 0.5 0.5 酪蛋白醋酸钠溶液 0.8 / / / 1mol/L醋酸 / 0.5 0．15 / 0．1mol/L醋酸 / / / 0．3 0．01mol/L醋酸 3.7 4.0 4.35 4.2 蒸馏水 4 3 2 1 试管号 溶液名称（ml) 每加一管摇匀一管，观察其混浊度，静止10分钟后，在观察其混浊度。最混浊的一管的PH即为酪蛋白的等电点。 （一）实 验 目 的 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义：了解蛋白质变性与沉淀关系。 （二）实 验 原 理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型： 1．可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。 2．不可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 双电层理论 中心称为胶核，其表面选择性地吸附了一层带有同号电荷的离子（可以是胶核的组成物直接电离产生的，也可以是从水中选择吸附的H+或OH-造成的），成为胶体的电位离子。 由于电位离子的静电引力，在其周围又吸附了大量的异号离子，形成了所谓的“双电层”。 (三）操 作 方 法 1、蛋白质的盐析 加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水是否溶解，为什麽？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 2、重金属离子沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，有沉淀产生，放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加少量的水，沉淀是否溶解？为什麽？ 3、某些有机酸沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 4、有机溶剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质溶液1ml，在加入2ml丙酮。混匀，观察沉淀的生成。 5、乙醇引起的变性与沉淀 取4支试管，编号。依下表顺