鳕鱼骨胶原肽与活性钙的制备及其抗骨质疏松活性分析-preparation of cod collagen peptide and active calcium and analysis of their anti-osteoporosis activity.docx

PAGE PAGE VI 鳕鱼骨胶原肽与活性钙的制备及其抗骨质疏松活性研究 摘 要 鳕鱼是全世界年捕捞量最大的鱼类之一，在我国分布广泛，具有重要的经济 价值。鳕鱼在加工生产过程中会产生大量的废弃物，其中鱼骨占鳕鱼整体重量的 15%。鳕鱼骨中含有丰富的胶原蛋白及多种矿质元素，是一种良好的天然蛋白源 与钙源。本论文以太平洋真鳕鱼骨为原料，制备鱼骨胶原蛋白并研究其各项基本 理化性质。使用商品蛋白酶水解制备鱼骨胶原肽，并研究不同分子量胶原肽对成 骨样 MG-63 细胞作用机制的影响。本实验研讨鳕鱼骨活性钙的最佳制备条件， 并对其生物利用度进行了研究。本论文以去卵巢大鼠为模型，探讨鱼骨胶原肽与 活性钙的抗骨质疏松活性。本研究开拓了鳕鱼骨资源的应用领域，为开发新型鱼 骨保健食品、推进水产品高值化利用的发展提供了一定的科学依据。 1. 本论文以水产加工下脚料鳕鱼骨为原料，因此首先对其基本组成进行了 分析。鳕鱼骨中蛋白质含量较高（14.5%），鳕鱼骨中含有 7 种必须氨基酸，占总 氨基酸含量的 26.02%。鳕鱼骨中 Ca 与 P 的含量分别达到 20.78%和 10.09%，其 比值接近 2:1。扫描电镜观察发现鳕鱼骨表面具有坚固致密的扁平板状的羟基磷 灰石结晶；通过 Van Gieson 染色发现鳕鱼骨中含有大量的胶原蛋白纤维。 2. 以鳕鱼骨为原料，通过不同方法制备胶原蛋白，并对所提取胶原蛋白的 理化性质进行分析。使用低温酸法制备得到酸溶性胶原蛋白（ Acid-soluble collagen, ASC）。氨基酸组成检测发现 ASC 中 Gly 的含量最高，而 His、Tyr 及 Ile 的数量很少。SDS电泳检测证明 ASC 为 I 型胶原蛋白，至少含有两条 α (α1 和 α2)链、一条 β 链和一条 γ 链。傅里叶变换红外光谱和 X-射线衍射等分 析证明 ASC 较好的保持了天然螺旋结构。扫描电镜观察发现 ASC 冻干样品具有 多孔的网状结构，且存在缠绕复杂的细丝结构。使用热水抽提法制备得到热水抽 提胶原蛋白（Hot-water extracted collagen, HEC）。采用正交实验确定了制备的最 佳条件: 盐酸质量分数 4%，酸处理时间 18h，提取温度 70℃, 提取时间 8h，样 品提取率可达 98.02%。制备 4 种 HEC 样品：45℃ 4h，45℃ 8h，70℃ 4h 和 70℃ 8h，氨基酸组成检测显示 4 种样品氨基酸组成无显著性差异，凝胶强度随制备温 度的升高和时间的延长而显著下降。傅里叶红外变换光谱和扫描电镜观察显示 HEC 失去天然三螺旋结构。 3. 以鳕鱼骨胶原蛋白为原料，以 MG-63 细胞碱性磷酸酶增长率作为活性筛 选指标，使用胰蛋白酶对胶原蛋白进行酶解以制备鳕鱼骨胶原肽。以正交实验设 计确定酶解优化条件参数为：酶解温度 50℃，酶解时间 90min，加酶量 1.5%。 在此优化条件下，ALP 增长率为 43.64%。以水解液为原料超滤获取高、低分子 量组分：BCH1:2000DaMw6000Da; BCH2:Mw2000Da，初步探讨了不同分子 量胶原肽组分（BCH1、BCH2）对 MG-63 细胞相关因子 mRNA 表达水平的影响。 结果显示胶原肽对细胞无明显细胞毒性，具有较好的安全性。两种胶原肽在 200μg/ml 浓度时均可显著提高 BMP-2 mRNA 的表达水平（P0.01），这说明胶 原肽可通过上调成骨细胞 BMP-2 的含量以促进成骨细胞的增殖与分化。两种胶 原肽均能够在促进 OPG 因子 mRNA 表达量（P0.01）的同时，显著抑制 RANKL 因子 mRNA 的表达水平（P0.01），且存在一定的剂量-效应关系，其中低分子 量胶原肽 BCH2 对 OPG/RANKL mRNA 表达比例的上调促进作用效果最好 （P0.01）。实验结果说明胶原肽能够有效提高细胞 OPG/RANKL mRNA 的相对 表达量，以间接对破骨细胞的成熟及活化进行调控。 4. 采用正交实验确定活性钙最佳提取条件为：提取温度 100℃，提取时间 120min，酸混合比例 1:2，酸质量分数 15%，在此条件下提取率达到 96.15%，其 中酸质量分数对结果的影响最为显著。对 CCM 活性钙样品进行生物利用度实验， 结果表明样品对大鼠没有显著毒副作用；与空白对照组相比，CCM 低剂量组大 鼠骨钙含量明显增加（P0.05），中剂量、高剂量与碳酸钙组大鼠的骨钙含量增 加极为显著（P0.01）；且 CCM 高剂量组大鼠骨钙含量与相同钙水平的碳酸钙 组无明显差异（P0.05）。钙代谢实验测定结果显示 CCM 高剂量组钙吸收率显 著高于相同钙水平的碳酸钙组（P0.05）。因此判断 CCM 样品可作