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实验五 人类淋巴细胞株培养 一、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌） 二、培养基的配制 三、细胞传代培养 四、死活细胞的鉴别 五、细胞生长曲线的测定 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。 体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。 灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。 四、仪器、材料和试剂 （一）仪器 超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器 （二）材料 微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um (三）试剂 75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl等 五、实验步骤 （一）清洗 1.新玻璃器皿的清洗 先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。 2.使用过的玻璃器皿的清洗 （1）立即进入清水，避免干涸难洗； （2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥； （3）浸酸性洗液过夜； （4）从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干； （5）包装（牛皮纸或不透水纸）； （6）高压（15磅20min)或干热（160度2h)灭菌； （7）备用。 （二）胶塞处理 （1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。 （2）自来水清洗10次 （3）用1%稀盐酸浸泡30min。 （4）自来水清洗10次，蒸馏水刷洗10次。晾干 （5）旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装高压灭菌，可使用。 （三）塑料制品的清洗 （1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍 （2）强（次强）酸洗液浸泡2~6h. （3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次 （4）浸泡在70%乙醇0.5~1h,备用。 （5）用前从乙醇中取出，在超净工作台内紫外线照射1h。 （四）Tip和Tube的清洗 （1）新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。 （2）用于RNA提取时，用蒸馏水刷洗后再用DEPC水（抑制RNA酶）浸泡过夜晾干，高压灭菌后使用。 （3）使用过的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/L NaOH或0.2mol/L HCl溶液中，清水洗过，自来水清洗10次晾干，进洗液2~24h。晾干，放入饭盒高压灭菌，备用。 （五）洗液的配制 常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不同的浓度 配制方法： （1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。 （2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。 注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。 （六）消毒和灭菌 （1）射线消毒灭菌 主要使用X、60Co进行消毒灭菌，用于牛血清或塑料制品。 （2）紫外线消毒 一般用无臭氧型紫外灯。一般20min，71%细菌消灭；40min后79%细菌消灭，60min后86%细菌消灭。紫外线照射时间照射再长也不能100%灭菌，最多只能达到90%。 （3）干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160度，保温90~120min。用于RNA提取实验的用品则需要180度，保温5~8h. （4）湿热灭菌 也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。 （5）滤过灭菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。 （七）化学消毒法 （1）70%（75%）酒精消毒 （2）0.1%新洁尔灭消毒 （3）来苏儿水消毒 （4）0.5%过氧乙酸消毒 （5）乳酸蒸汽消毒 （6）37%甲醛加高锰酸钾消毒 （7）煮沸消毒 六、实验报告 根据安排配制洗液，写出配制过程和遇到的问题 填表 * * 50 000ml 1 000ml 10 000ml 200ml 蒸馏水 10 000ml 200ml 50 000ml 1 000ml 浓硫酸 6000g 120g 3150g 63g 重铬酸钾 次强酸洗液 强酸洗液 成分 加样器吸头 微量离心管 塑料制品 胶塞 旧玻璃器皿 新玻璃器皿 注意事项 清洗步骤 器皿种类