课件46-高级生物化学与分子生物学-生物大分子相互作用研究.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 分子间的相互作用是所有生物学过程发生的基础 酵母杂交系统的总结与展望 类 型 所能回答的问题 单杂交 反向单杂交 双杂交 反向双杂交 三杂交 反向三杂交 N杂交 反向N杂交 蛋白质与DNA之间是否存在相互作用 蛋白质与DNA之间相互作用的细节 两种蛋白质之间是否存在相互作用 两种蛋白质之间相互作用的细节 一种蛋白质、RNA或其它小分子物质是否同时与两种蛋白质之间存在相互作用 三元复合物各成分之间的相互作用细节 N元复合物各成分之间所存在的相互作用关系。 N元复合物各成分之间相互作用的细节。 分子间的相互作用是所有生物学过程发生的基础 酵母杂交系统的缺陷 1 对于所研究的绝大多数目标分子来讲，无论如何 酵母细胞毕竟不是真正意义上的生活环境。 2 对于那些不是定位于核内发挥作用的目标分子来 讲，用酵母杂交系统全部定位于核内进行研究将 导致出现各种微环境上的不协调性，无论如何这 种情况是难以避免的，这也许是导致各种假性结 果生成的原因之一。 3 以融合的策略所构建的无论是诱饵蛋白，还是猎 物蛋白等等，目标分子与AD或BD之间的相互干扰 作用是有可能存在的。这将是导致各种假性结果 生成的最主要原因。 生物分子相互作用实时分析 （Biomolecular Interaction analysis，BIA） 分子间的相互作用是所有生物学过程发生的基础 1 BIA的概念 2 BIA的原理 3 BIA的应用 4 BIA的特色与优点 分子间的相互作用是所有生物学过程发生的基础 BIA的概念 BIA是一种通过生物传感手段对生物分子间的相互作用在免标记状态下进行适时追踪分析的技术。 棱 镜 光信号处理器 反射光 BIA的原理 传感图 时间 共振单位 偏振光 棱 镜 光信号处理器 反射光 BIA的原理 传感图 时间 共振单位 偏振光 分子间的相互作用是所有生物学过程发生的基础 BIA的应用 ? 从细胞或组织粗提液中筛选细胞受体的未知配体。 ? 测定抗原-抗体反应亲和力和反应动力学参数。 ? 信号传导机理的研究。 ? 癌基因表达产物致癌作用机理的研究。 ? 进行药物的快速筛选与鉴定。 ? 适时监测分子生物学过程—酶切、DNA合成、杂交。 分子间的相互作用是所有生物学过程发生的基础 BIA的特色与优点 ? 在免标记状态下对生物分子相互作用进 行研究 ? 可以对生物分子之间相互作用的动力学过 程进行适时监测。 ? 快速且实现了自动化。 ? 可以与质谱联用。 ? 所分析的样品无需进行复杂的前处理。 反义 RNA（Antisense RNA ） 分子间的相互作用是所有生物学过程发生的基础 反义RNA是一种内源性或外源性的能够抑制基因表达的RNA。它通过碱基互补配对与靶基因的mRAN前体分子或成熟mRAN分子结合，从转录、转录后加工、运输或翻译等几个层面上调控基因的表达。 ? 转录层面：大多数基因在转录时要在mRAN前体分子上形成一个或多个特定的茎环结构，这是转录的基本步骤。反义RNA与靶基因的mRAN前体分子结合，阻止了茎环结构的形成，进而抑制转录。 反义RNA抑制基因表达的作用机制。 ? 转录后加工层面：mRAN前体分子在转录后需要剪接处理，即除去中间的内含子后再将外显子连接起来以形成成熟的mRAN。反义RNA可以封闭外显子与内含子之间的剪接点部位，阻断剪接而抑制mRAN分子的成熟化。 ? mRAN分子的运输层面：成熟的mRAN分子一定要被运输到核外，反义RAN分子与mRAN分子结合，影响其运输。 ? 翻译层面：反义RAN分子可以与成熟的mRAN分子的5’端结合，阻断mRAN-核蛋白体小亚基的形成，即阻断了翻译的起始；或者反义RAN分子与成熟的mRAN分子的多聚腺苷酸尾巴结合以实施对翻译过程的抑制。 外源性反义RAN分子的应用及其问题。 1 用于研究基因的功能以及探索基因间的相互关系， 特点突出、优势明显，主要表现在如下几个方面： ? 靶基因范围广—不被翻译成蛋白质的基因、仅 知道部分序列的基因、细胞本身的其它各种基因 以及整合入细胞基因组的各种外源基因等。 ? 特异性强—只封闭靶基因的表达。 ? 可进行人为控制—在构建反义RNA载体时可以加 上可诱导的启动子、增强子等调控元件，对反义 RAN的表达时间和表达量实施控制。 ? 操作简单—比单克隆抗体法要简单得多。 2 用于基因治疗