肿瘤的血管生成ppt课件.ppt

7.激光扫描共聚焦显微镜三维重建法 激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。 激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究，神经递质研究，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。  共聚焦显微镜的分辨率超过普通光学显微镜，染色过程简便，可以在活细胞上进行无创伤性的染色，最大程度地维持细胞的正常形态。多种自发性的荧光染料，已被广泛地用于诸如RNA、DNA细胞核、线粒体、内质网、肌动蛋白、细胞膜等结构的标记。运用免疫荧光技术，将不同波长的两三种荧光物质标记在内部不同结构的相应抗体上，以这几种荧光物质特定的光谱特性选择激发光和滤光片，则可以观察到细胞内部各结构间的毗邻关系。 共聚焦显微镜生成厚度小于0.2微米的依次相连的光学切片，即使较厚的组织的三维数据也可被计算机获取，运用适当的图像分析软件，可以测量并确定所观察结构的表面特征，体积等参数，为相互结合定量测量提供了新手段。  激光扫描共聚焦显微镜可以将各层面的微血管图像进行三维重建和处理。从而，可以分析微血管的三维立体特征及其空间关系。 8.血管内皮迁移实验 目前，对血管内皮细胞迁移的影响，已经有很多有效的测定方法。其中以改良的Boyden Chamber 或Transwell 法最常用。这些方法均是通过观测穿过一定孔径(如8 μm) 硝酸纤维素薄膜的细胞数量,确定细胞迁移能力。 8.1 Boyden Chamber 实验: Boyden室由两层组成,两层之间为胶原包被的多孔的多聚碳酸盐滤膜;血管内皮细胞放于上层,同时加入待测药物,共同培养6h后,除去上层的细胞,下层细胞用甲醇固定, HE染色,光镜下计算下层的血管内皮细胞数。 该方法优点在于它对药物浓度梯度差异很敏感。但对实验技术要求较高且计数方法不同可能会造成统计结果误差较大。因此有必要建立一个严格的计数标准以减少因方法不同产生的误差。 8.2 Transwell实验： 这项技术的主要材料是 Transwell小室，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，根据实验需要，可有不同选择。其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0微米，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜。将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。  8.3划痕损伤实验： 在国外出现较早。用移液器滴头或刀片在单层血管内皮细胞的培养皿上划痕，为边缘内皮细胞迁移提供一裸露区域。经过创伤后边缘的单层内皮细胞可迁移至创伤区域，并重新形成新的单层内皮细胞层。在光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数和迁移的相对距离，并计算出细胞的实际迁移距离。然而这种方法的定量具有任意性。 9.小管形成实验 　小管形成实验能模拟人体内毛细血管生成的过程,包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤,接近人体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时能形成网状结构。用电子显微镜来分析小管间的紧密连 接,从而定量血管生成情况。 实验一般采用24孔培养板,但它底面积大，Matrigel 用量多,计数区域大只能随机选择几个典型区域且数据分析耗时长。 Sanz等采用384孔和536孔培养板培养可节约胶的用量,借助计算机可以计算整个孔的小管及小管之间的连接数及小管的长度和面积。改进方法后减少了原来分析困难及重现性差的缺点。 10.器官培养测定实验 　　器官培养实验极大地推进了对血管形成的测定。器官血管形成测定法包括鼠主动脉环、鸡主动脉弓、猪颈动脉、胎儿鼠骨移植测定法等。这些测定法非常相似，其中鼠主动脉环