膜片钳技术原理及相关基本知识.ppt

200B P-2000 P-97 Sutter公司微电极拉制器 Electrophysiology-Apparatus 日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪 机械系统:由于膜片钳实验是一个微电和微操作实验，任何微小的震动都会影响电极和细胞的封接，导致实验的失败，因此一台高质量的防震台是必须的。 基本原理 利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。 膜片钳（patch clamp） 内尔(Neher) 萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家） 合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。 膜片钳 研究离子通道的一种电生理技术，是施加负压将玻璃微电极的尖端(开口直径约1 μm)与细胞膜紧密接触，形成高阻抗封接，可以精确记录离子通道微小电流。能制备成细胞贴附、内面朝外和外面朝内三种单通道记录方式，以及另一种记录多通道的全细胞方式。 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。 膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜电位的基础上改变膜电位，记录离子通道电流的变化，记录的是诸如通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。是膜片钳的基本工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入刺激电流，记录膜电位对刺激电流的反应。记录的是诸如动作电位，EPSP;IPSP等电压信号。 膜片钳 为了记录到膜电位，电极尖端必须与要记录细胞的细胞膜形成紧密的封接，故又称紧密封接。 电压钳位(tight-seal voltage clamp )，这种紧密封接可使电阻达到千兆欧(10 9)级，故称为“千兆欧封接”( gigaseals ) 膜片钳技术实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻（ 10ＧΩ ）密封,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。 膜片钳技术的优点 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。 膜片钳记录方法按照微电极尖端是吸住细胞膜不损伤它，还是吸出细胞膜片，或按吸出的细胞膜片是原来胞质侧还是细胞外侧暴露在浸泡液中，可将膜片钳技术分为4类， 即细胞附着膜片(cell-attached patch )、全细胞记录(whole-cell recording、外膜外向(outside-out )和内膜外向(inside-out)膜片技术。 细胞贴附式 全细胞记录式 外面向外式 内面向外式 单通道电流 膜电位或膜电流 膜片钳的几种记录模式极其形成： 各种记录模式的形成过程 10μM 10μM a 膜片钳使用的标本 1.单细胞：急性分散细胞和培养细胞 2.脑片或组织块。 3.整体动物。 要求：膜片钳80%的工夫在于制备细胞。细胞表面要干净,不能有胶质细胞等蛋白质物质。细胞状态良好，表面光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。 脑片 单细胞 电流信号 单通道电流 全细胞电流 突触电流 电压信号 阈电位 静息电位 动作电位 膜片钳记录的信息 电压钳模式 电流钳模式 1.单通道电流 1.典型的单通道电流呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。他有两个电导水平，即0和1，分别对应通道的关闭和开放状态。 2.有的矩形脉冲簇状发放时，通道电流不在同一水平，可以明显观察到不同数目离子通道所形成的电流台阶，从而可推断出被测膜片的通道数目。 3.有的通道可记录到圆滑型和方波形两种形式。 4.有些通道开放活动是持续开放，中间被闪动样的关闭所中断，形成burst开放。有些通道开放活动是簇状开放与短期平静交替出现，形成簇状发放串（Cluster) 2. 全细胞电流 全细胞电流是一些形状各异的电流曲线