VSV病毒扩增与标定.doc

50％组织细胞感染量(TCID50)试验 指能使半数单层细胞管(孔)出现细胞病变的病毒稀释度。此法估计病毒感染性的强弱和含量，不能准确测定感染性病毒颗粒的多少。 1．待测病毒液按10倍系列稀释法稀释 2．各稀释度的病毒接种于形成单层的细胞瓶或培养板（每稀释度接种几 瓶）。 3．将细胞瓶或培养板置于温箱37℃培养数日。 4．观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按 Reed Muench 法计算出该病毒液的TCID50效价。 　例如使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，其中间距离比例按下式计算： 中间距离＝高于50％的病变率（按瓶计）－50/高于50％的病变率－低于50％的病变率。 假定中间距离为0.5。故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4.5，即TCID50为 104.5倍，当病毒悬液做104.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50。 50-100T CID50的VSV 就是发生的病变时的的VSV稀释浓度的倍数。 2.1 材料与仪器 2.1.1 实验材料 Eagle’s 最低限度培养基（MEM）：MEM 粉末（Gibco 公司产品，1L 装）溶 于1L 双蒸水，0.22μm 微孔膜过滤除菌，分装，37℃无菌检验一周后，置于4℃保存。使用前加入经56℃水浴灭活30min 的新生小牛血清（四季青生物工程材料有限公司产品），双抗（青霉素和链霉素各250 单位/mL），用NaHCO3 调pH至7.2~7.4。 1%维尔烯（Versene）：EDTA 10.0g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.15g， NaH2PO4 0.2g，葡萄糖0.2g，加去离子水至1000mL，pH7.4。 细胞消化液：1%胰酶（Difco）5mL，1%维尔烯（Versene）2mL，用不含钙 和镁的PBS（pH=7.2）定容至100mL。Difco 和Versene 的最终浓度分别为0.05% 和0.02%，用无菌膜过滤除菌后备用。 结晶紫染液：结晶紫0.5%（w/v），NaCl 0.85%（w/v），乙醇50%（v/v）， 甲醛3%（v/v），蒸馏水47%（v/v）。 脱色液：乙二醇甲醚（Ethylene Glycol Monomethyl Ether）50%，蒸馏水50%。2.1.2 实验仪器 酶标仪MR550 型：美国Bio-Rad 公司产品； 倒置显微镜IMT-2 型：日本Olympus 公司产品。 2.1.3 测定细胞与攻击病毒 人羊膜细胞（WISH）株和水泡性口炎病毒（VSV）株：由上海第二军医大 学惠赠。 2.1.4 标准品 干扰素α 标准品（Lot 03/94，效价12,000 IU/mL）100 倍稀释分装：由上海 第二军医大学惠赠 2.2 实验方法 2.2.1 Wish 细胞的培养 取出保存于-80℃的Wish 细胞株，37℃水浴解冻后，1000r/min 离心5min， 弃上清；沉淀用含10%小牛血清的MEM 培养液悬浮，移至细胞培养瓶，加入适量培养液置于含5％CO2 的37℃培养箱内，出现均匀的单层细胞，每2~3 天传代一次，实验时取对数生长期细胞。 2.2.2 VSV 的扩增与保存[80] 用含10%小牛血清的MEM 培养液按1:200 稀释VSV，接种于生长良好的单 层Wish 细胞中进行增殖，孵育至细胞病变达75%~100%时，即可冻存于-20℃以下。次日取出，反复冻融2~3 次，再用巴氏管吹打，3000r/min 离心20min，收集上清。根据每次用量分装，冻存于-80℃以下，毒种应冻存于液氮中。 VSV 容易在生长繁殖中产生各种变异株，其中最重要的是一种所谓“缺陷型 干扰颗粒”（Defective Interfering Particles，DI）变异株。DI 颗粒是一种比正常 VSV 病毒小得多的不完全的病毒体，所含RNA 较小，缺少转录酶活性，所以 DI 颗粒感染细胞后单独不能增殖，必须与野生株一起才能增殖。。但是，DI 颗粒与野生株一起增殖时，又会“竞争性”地抑制后者，并因此出现“自身干扰现象”。另外，这种DI 颗粒还可导致“超敏感细胞”，形成“持续感染状态”，这种处于持续感染状态的细胞对野生病毒攻击有抵抗力。当用VSV 的野生株以高“感染复数”（MOI，即低浓度稀释）进行连续传代时，即可产生大量的DI 颗粒，并因而使病毒滴度急骤下降。。防止DI 颗粒形成的措施是：首先应以低“感染复数”传代，其次应尽可能减少传代次数。因此，为防止产生DI 颗粒，每次扩增的量至少应够用6 个月以上 2.2.3 VSV 效价的滴定[81] 每次VSV 扩增之后，应进行VSV 效价滴定，以确定本批次病毒的活性并计 算TCID50。 将生长良好的单层Wish