基因工程与基因体外表达.docVIP

第十三章 基因工程与基因体外表达 基因克隆 限制性核酸内切酶 二．基因克隆中具有不同功能的工具酶 基因克隆中特定的DNA载体 一．常用克隆载体（质粒和病毒） 二．表达载体将外源基因带入宿主并进行表达 第三节 基因克隆的过程 获取目的基因 选择和准备载体 DNA片段的连接 重组DNA导入宿主细胞进行扩增 筛选与鉴定 第四节 真核细胞基因转染 真核细胞转染的方法与原理 转染细胞利用抗性标记进行筛选 利用重组DNA技术对基因进行改造 对特定基因的定点诱变 利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白的特性 克隆基因在适当的宿主细胞表达 大肠杆菌表达系统 哺乳动物细胞外源基因的表达 其他宿主细胞中也表达制备真核蛋白 第七节 电子克隆 本章重点: 掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。 熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点 了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组 本章难点 两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较 核心词：DNA重组 基因克隆 载体 宿主细胞 基本概念： DNA重组（DNA recombination）：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。 基因克隆（gene cloning）：主要是进行制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制，扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝的过程。 基因工程（genetic engineering）：基因克隆后，利用克隆基因表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。 重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术。基因工程与蛋白质工程，酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴学科领域——生物技术。 基因克隆 限制性核酸内切酶 在基因克隆中用于切割DNA。能识别双链DNA分子内部的特异位点并且裂解磷酸二酯键。 至今发现的有三种类型：Ⅰ型酶，Ⅱ型酶，Ⅲ型酶。 基因工程中常使用Ⅱ型酶。它在基因克隆中得到广泛应用，是最重要的工具酶，它能识别DNA分子内部的特异位点和切割双链DNA，其切割位点的序列可知，固定。通常所说的限制性内切酶就是指这一类酶。 限制性内切酶特点：具有特定的识别和切割位点，通常是4－6个碱基对，具有回文序列（palindrome）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末端（sticky end）. 同工异源酶：来源不同而功能相同的一类酶。举例：BamHI和SstI等。 同尾酶：切割DNA后产生相同末端的酶。 二．基因克隆中各种具有不同功能的工具酶 1．DNA聚合酶Ⅰ：常用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ。DNA聚合酶I的分子量为l09kD，是一条约1000个氨基酸残基的多肽链。它具有三种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性（能以单链DNA为模板，在3’-OH引物的引导下，按5’→3’方向，合成互补的DNA序列）；②3’→5’外切核酸酶活性(能够去除延长的核酸链上的3’-OH末端上的核苷酸，可以沿3’→5’方向降解双链或单链DNA，释放5’单核苷酸；③5’→3’外切核酸酶活性(能从DNA链5’-OH末端降解双螺旋DNA的一条链，沿5’→3’方向，释放出单核苷酸或寡核苷酸)。DNA聚合酶I的主要用途：①用切口平移方法标记DNA(可作杂交探针)；②利用其5’→3’外切核酸酶活性降解寡核苷酸作为合成cDNA第二链的引物；③用于对DNA分子的3’突出尾进行末端标记，用于DNA序列分析。大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(K1enow片段)：K1enow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I产生，或通过克隆技术而获得。此酶是单一多肽链，分子量76kD。它具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，而无5’→3’外切酶活性。 2．Klenow片段（Klenow fragment）：①补平限制性内切酶切割DNA产生的3’凹端；②用[32P]dNTP补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记；③对带3’突出端的DNA进行末端标记；④在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；⑤在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA；⑥应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序。 3.逆转录酶（re