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摘 要
目的:探讨姬松茸多肽的抗衰老作用及其机制。
方法:硫酸铵沉淀及酶解法提取多肽,DEAE-32,Cellulose CM-52 和Sephadex
G-25柱层析纯化得ABp;继续利用Superdex 30柱层析纯化得到ABp-S2,分析
ABp-S2 中组分构成;ICR 小鼠分为空白对照组 (Con)、模型组 (Mod)、吡拉
西坦组 (Pir)及姬松茸多肽组 (ABp);通过避暗仪和Morris 水迷宫测试小鼠
的学习记忆能力;检测小鼠血清中丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)、总抗氧化
能力 (Total antioxidant capacity,T-AOC)、过氧化氢酶活性 (Catalase,CAT)和活
性氧 (Reactiveoxygen species,ROS)含量,HE 和免疫双荧光染色法观察海马神
经元结构变化;转录组学测序 (RNA-seq)分析基因的差异表达;qRT-PCR 验证
显著差异基因mRNA 表达量;Westernblot 检测脑组织中Keap1、Nrf2、HO-1、
P53、Hsph1、Apoe、Trim32 蛋白表达量。利用MTT 法检测ABp-S2 中不同多肽
对衰老细胞的修复率。小鼠胚胎成纤维细胞 (NIH/3T3)分为Con 组、Mod 组、
姬松茸多肽低剂量组 (ABp-RQR-L)、姬松茸多肽中剂量组 (ABp-RQR-M)姬
松茸多肽高剂量组(ABp-RQR-H),检测细胞外液中CAT、MDA、ROS、T-AOC、
炎症因子白介素-1β (interleukin-6,IL-1β)、炎症因子白介素-6 (interleukin-6,
IL-6)、肿瘤坏死因子 (tumornecrososfactor,TNF-α)含量。β-半乳糖苷酶染色
法观察细胞形态及阳性细胞百分率。Western-blot 法检测Keap1、Nrf2、HO-1、
TLR4、NF-κBp65细胞因子表达水平以及应用ML385 阻断剂后Nrf2、HO-1蛋白
因子的表达变化。
结果:经柱层析纯化分离纯化后得单峰即为ABp,分子量 (M)3kD;ABp-S2
由多肽ABp-RRQ、ABp-RQR、ABp-TRAR 构成;其中ABp-RQR 为主要活性成
分;与Mod 组比较,ABp 组小鼠水迷宫及避暗潜伏期缩短,错误次数减少 (P
<0.05);血清中CAT、T-AOC 明显升高,ROS、MDA 含量下降 (P<0.05);
HE 染色结果显示ABp 组神经元排列紧密,核固缩细胞数量减少;ABp 组与Mod
组比较,筛选出差异基因295个,基因上调有79个,下调216个;qRT-PCR 验
I
证结果显示ABp 组脑组织中Hsph1、Trim32、HK1、HnRNPA1、Grik5mRNA
表达量增高,Apoe、Atp1a3、Stxbp1、Mapk8ip1mRNA 表达量降低 (P<0.05)。
Westernblot 结果ABp 组脑组织Keap1、P53 蛋白表达量降低,Nrf2、HO-1、Hsph1、
Trim32 蛋白表达量升高 (P<0.05)。与Mod 组比较ABp-RQR 各组中SOD、
CAT活性增强,MDA及ROS含量降低,IL-1β、IL-6及TNF-α含量下降(P<0.05);
β-半乳糖苷酶染色显示ABp-RQR各组与Mod组比较形态规则且阳性细胞数目减
少 (P<0.05);与Mod 组比较ABp-RQR 各组中Nrf2、HO-1、TLR4、NF-κBp65
表达升高,Keap1表达降低 (P<0.05)。ML385 干预后ABp-RQR 组Nrf2 及
HO-1细胞因子表达减弱 (P<0.05)。
结论:ABp 可以改善衰老模型小鼠体内的氧化应激损伤,起到抗衰老的作用;
具体机制可能通过调控相关因子Apoe、Hsph1、Trim32、Atp1a3、Stxbp1、
Mapk8ip1、HnRNPA1、Hk1、Grik5mRNA 的表达有关;ABp-RQR 可以改善D-gal
诱导的NIH/3T3 细胞的衰老;具体机制可能通过调控 Keap1/Nrf2/ARE 和
TLR4/NF-κBp65信号通路减轻氧化-炎症反应以产生抗衰老作用。
关键词:姬松茸;ABp-RQR;衰老;Nrf2/ARE;TLR4/NF-κBp65
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