【课件-组织化学】_免疫电子显微镜技术.ppt

X45,000→ ←X7,500 标记物 酶、铁蛋白、胶体金 1 .酶标记－HRP(40KD) 小，易穿透，稳定 通过戊二醛（过碘酸钠），将抗体IgG或SPA与HRP交联 直接法、间接法、PAP法、ABC法等均可 Fab’－HRP 分子量小（70KD）利于抗体穿透 优点：可借鉴免疫组化（光镜）所用之试剂、操作 步骤、及所示结果，易获成功 缺点：弥散，密度较低，定位精确性较差，不宜对比染色 PDGF-R 2.铁蛋白 12nm颗粒（大），中心是Fe(OH)3 外围蛋白质 分子量大（440KD），穿透力差 易与环氧树脂非特异吸附而出现背景“着色” 3.胶体金 理想 2HAuCl4+ 3H2O2 2Au–+8HCl+3O2 (还原剂) 胶体金颗粒 （溶胶) —— Au IgG (IG) Au SPA (PAG) 密度梯度离心 柱层析（S－400） 去除大颗粒聚合物及未标记蛋白 还原剂 白磷 5nm 抗坏血酸 8～13nm 枸橼酸钠 15nm 双标或多标 TNF-R1 ×21000 VWF ×73000 TNF-R2 ×46000 胶金标记之优点： ① 抗体活性高 ② 可作光镜对照观察（免疫金银法） ③ 可作对比染色，超微结构清晰 ④ 可作双标或多标记 ⑤ 颗粒可定量计数 注意： ⒈ 间接法时，一抗不能用Fab’；用PAG时，一抗不能用羊IgG ⒉ 小颗粒（5nm）胶体金不易观察 包埋前法（浸透法） 免疫细胞化学反应→超薄切片制备 → 电镜观察 （厚片） 包埋后法（浅表法） 超薄切片制备 → 免疫细胞化学反应→电镜观察 （固定、脱水、包埋、超薄切片） 不包埋法 冰冻超薄切片→免疫细胞化学反应→电镜观察 包埋前法 1. 取材：新鲜、1mm3（脑、脊髓灌注固定后取） 2. 固定与切片： ①前固定：处理好“保持抗原性与保持超微结构”的矛盾 ②复合固定液的应用 PG固定液：1 ～ 4% Paraformaldehyde 0.01～0.2％ Glutaraldehyde PLP固定液：Periodate-lysine-Paraformaldehyde （配制方法见附录） ③厚切片（10～40μm） 振动切片机的应用，或浸泡于20～30%蔗糖溶液、 速冻、冰冻切片 ④继续固定 4℃ 4～5h ⑤彻底清洗 4℃ PBS(含2～5％蔗糖)过夜 3．免疫细胞化学标记 注意： ①用漂染 ② 增加抗体浓度（4～5倍） ③ 1%BSA的应用 ④ 用免疫酶标时，免用H2O2 ⑤ 想方设法增加抗体之穿透力 ① 去垢剂的应用 0.01～0.2% Saponin或Triton X-100 5-10’ ② 反复冻融 先浸泡于20％甘油或蔗糖（或10％DMSO），液氮速冻， 室温溶解，重复2～3次 ③ 增加PBS的离子浓度 ④ 应用Fab’－HRP以减少抗体分子量 ⑤ 延长作用时间，4℃过夜 ⑥ 反复脱水、水化（不适用于膜受体的研究） 增加抗体穿透力的措施 4.超薄切片制备 ⒈1％锇酸后固定，1h ⒉0.01mol/L pH 7.4 二甲砷酸钠缓冲液内过夜 ⒊脱水、浸透（适当压缩时间） ⒋包埋、聚合 ⒌超薄切片（如为免疫酶标，不作对比染色，应尽早 　电镜观察） 包埋后法 制备超薄切片 → 免疫细胞化学染色 （镍网或金网） （无需脱树脂） 优点：简便、重复性好、可作多标记 缺点：操作过程中抗原性受损，阳性率低 * * * * * * * * * * * * * * * * * * IgG之分布，免疫复合物及GBM处沉积（抗基膜性肾炎） * 免疫电子显微镜技术 0.2mm 0.2μm 0.2nm 像差