江西诺德-叶酸检测试剂盒SOP.pdf

叶酸代谢能力 （MTHFR ）基因型检测 1. 项目名称：叶酸代谢能力 （MTHFR ）基因型检测 2. 实验原理： 应用一对双标记 Taqman 探针，分别针对双等位 SNP 的不同基因型，只有完全匹配的探针 扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料 Fam，Hex （Vic ）分别标记这两种探针，就可 以在一次PCR 反应中完成对单个SNP 位点的基因型判定。 3. 试剂： 3.1 TIANGEN 血液基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Blood DNA Kit DP318 ），规格为50 次/盒，保存于室温。有效期12个月，在效期内使用试剂。 名称 含量 名称 含量 细胞裂解液CL 60 ml 洗脱缓冲液TB 15 ml 缓冲液GS 15 ml Proteinase K 1 ml 缓冲液GB 15 ml 吸附柱CB3 50 个 缓冲液GD 13 ml 收集管 50 个 漂洗液PW 15 ml 1.5 50 个 3.2 江西诺德医疗器械有限公司的叶酸代谢能力测定试剂盒，规格为200 测试/盒（6 μl 体 系，如20 μl 体系则为50 测试），-20 ℃保存。有效期12 个月，在有效期内使用。 名称 成分 含量 荧光基团预混液① MTHFR A1298C 位点试剂 1 ml 荧光基团预混液② MTHFR C677T 位点试剂 1 ml 纯化水 阴性 1 ml 阳性样本1-A MTHFR A1298C-CC （突变纯合） 60 阳性样本1-B MTHFR A1298C-AC （突变杂合） 60 阳性样本1-C MTHFR A1298C-AA （野生型） 60 阳性样本2-A MTHFR C677T-CC （野生型） 60 阳性样本2-B MTHFR C677T-CT （突变杂合） 60 阳性样本2-C MTHFR C677T-TT （突变纯合） 60 4. 仪器： 4.1 离心机 4.2 荧光定量PCR 仪 5. 方法： Taqman 探针法 6. 操作步骤： 6.1 对标本进行编号，并录入LIS 系统； 6.2 样本处理: 使用前先在缓冲液GD 和漂洗液PW 中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 6.2.1 在离心管中加入200 μL 血液： 6.2.2 加入20 μl Proteinase K 溶液，混匀。 6.2.3 加200 μl 缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10 min，其间颠倒混匀数次。（水 浴后颜色可能为深褐色，注意溶液中没有团块等沉淀。） 6.2.4 加200 μl 无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。 6.2.5 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中（吸附柱CB3 放入收集 管中），12,000 rpm(13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3 放入收集 管中。 6.2.6 向吸附柱CB3 中加入500 μl 缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm(13,400×g)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。 6.2.7 向吸附柱CB3 中加入600 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm(1