大麦S-腺苷甲硫氨酸合成酶HvSAMS2基因的克隆及耐盐性功能分析.pdf

摘 要 摘 要 大麦（Hordeum vulgare L. ）是对盐胁迫耐受性最强的禾本科作物之一，大麦品种 间在耐盐性方面表现出相当大的遗传变异。从大麦中鉴定响应盐胁迫的基因并对其功 能进行研究，对培育适合盐害地区的品种有重大的意义。S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因是 响应盐胁迫的一个重要基因。本研究以农家二棱大麦为材料，克隆了一个 S-腺苷甲硫 氨酸合成酶基因HvSAMS2 ，通过生物信息学手段分析了目的基因的理化性质，使用qRT- PCR 分析了该基因表达模式、利用农杆菌介导进行了亚细胞定位分析、酿酒酵母和拟 南芥转化，探讨HvSAMS2 基因的功能。主要研究结果如下： 1、利用同源克隆从大麦中克隆到了 HvSAMS2 基因。生物信息学分析显示， HvSAMS2 基因ORF 长度为1185 bp，编码394 个氨基酸，编码蛋白是一种稳定的亲水 性蛋白，分子量为42.83kDa ，理论PI 为5.58 。系统进化分析表明，HvSAMS2 编码的蛋 白与粗山羊草亲缘关系最近，序列相似性高达93.06% 。 2 、 HvSAMS2 的表达模式具有组织特异性，根中表达量最高，叶片的表达量次之， 茎中的表达量最低。HvSAMS2 蛋白定位于细胞核和细胞膜上。 3、构建过表达载体pYES2-HvSAMS2 、转化酿酒酵母营养缺陷型INVSc1 进行异源 表达。正常条件下，HvSAMS2 转基因菌株与转空载体酵母菌株的生长情况没有差异， 在不同浓度盐胁迫下，随着时间的增加，两种菌株的生长差异逐渐显著，转基因菌株表 现出更好的耐盐性。 4 、构建过表达载体HvSAMS2-PGreen 转化拟南芥，分析了纯合转基因植株在盐胁 迫条件下的表型。转基因拟南芥在盐胁迫下的鲜重及根长损失率远低于野生型及插入 突变体。 5、HvSAMS2 基因参与盐胁迫的响应过程，主要通过提高亚精胺和精胺含量来提升 植物对盐胁迫的适应能力。 HvSAMS2 基因的克隆及功能分析、为探究大麦逆境胁迫的耐受机制以及通过生物 技术改善转基因植物抗性具有重要的理论与实践价值。 关键词：大麦；基因克隆；S-腺苷甲硫氨酸合成酶；盐胁迫 I 目 录 目 录 摘要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1 土壤盐碱化 1 1.1 1 土壤盐碱化的原因 1 1.1.2 土壤盐碱化的应对措施 2 1.1.3 盐胁迫对植物的影响 5 1.2 植物的耐盐机理 9 1.2.1 SOS 信号传导途径 9 1.2.2 渗透调节 10 1.3.3 活性氧解毒信号通路 11 1.3 S-腺苷甲硫氨酸合成酶研究进展 14 1.3.1 MAT 基因及其同工酶 14 1.3.2 MAT 和MAT 复合物 14 1.3.3 植物中的MAT 15 1.4 本研究的目的意义及技术路线 17 1.4.1 目的及意义 17 1.4.2 技术路线 18 第二章 HvSAMS2 基因的分子克隆及分析 19 2.1 实验材料及试剂 19 2.2 实验方法 20 2.2.1 大麦全基因组DNA 的提取 20 2.2.2 HvSAMS2 基因的扩增 21 2.2.3 PCR 产物的回收 21 2.2.4 HvSAMS2 基因与载体的连接、转化和筛选 22 2.2.5 HvSAMS2 基因的生物信息学分析 2