两株新城疫病毒HN蛋白介导膜融合活性差异的研究.pdf

摘要 两株新城疫病毒HN 蛋白介导膜融合活性差异的研究 摘要 新城疫（Newcastle disease ，ND ）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus ，NDV ） 所引发的一种严重危害世界养禽业的传染病，可分为强毒株、中毒株和弱毒株三种毒 株，其中强毒株可100 %致死感染家禽。NDV 上的血凝素-神经氨酸酶（HN ）蛋白和 融合（F ）蛋白均是位于病毒粒子囊膜表面的糖蛋白，它们的相互作用是发挥膜融合 形成合胞体的关键。而HN 蛋白在NDV 的生命周期中主要发挥受体结合、促膜融合、 神经氨酸酶（NA ）活性，已有研究表明，NDV 的致病性和膜融合与HN 蛋白有关。 本实验室前期从野鸟体内分离的两株NDV （NDV-Blackbird 和NDV-Dove ）同源性极 112 117 高，F 蛋白序列完全相同且裂解基序均为 R-R-Q-R-R↓F （强毒株和中毒株的裂解 基序），HN 蛋白上仅有5 个氨基酸突变（AAs ：54、110、116、469 与522 ），但毒力 测定发现NDV-Blackbird 是强毒，NDV-Dove 是弱毒，而且它们在细胞上产生的合胞 体大小差异显著。为了探究这5 个氨基酸变异对两株NDV 膜融合活性的影响及影响 途径，本论文从以下几方面展开研究： 1. 两株NDV 的生物活性分析 将两株NDV 分别感染BHK21 细胞24 h 后，通过ImageJ 软件分别统计它们所产 生的40 个合胞体的直径用以比较膜融合活性的差异，发现NDV-Blackbird 产生的合 胞体明显大于NDV-Dove 。通过蚀斑法测定接毒后不同时间点的病毒滴度来检测它们 在DF-1 细胞中的增殖情况，发现NDV-Blackbird 的增殖速度明显快于NDV-Dove 。 同时，在感染BHK21 细胞24 h 后，利用血吸附（HAd ）试验和神经氨酸酶（NA ）检 测试剂盒分别检测了它们的受体结合和神经氨酸酶活性，发现NDV-Blackbird 的受体 结合和神经氨酸酶活性均明显高于NDV-Dove 。 综上所述，研究结果表明，两株NDV 膜融合活性的差异可能与增殖能力差异和 HN 蛋白功能活性差异相关。 2. 两株NDV 的HN 蛋白差异位点分析 通过统计两株NDV 编码结构蛋白中的差异氨基酸，并利用PyMOL 软件分别构 建HN 蛋白的三维结构模型，对HN 蛋白上差异氨基酸的位置进行了分析。同时，收 112 117 集GenBank 中裂解基序均为 R/K-R-Q-R/K-R↓F 的763 株NDV 的序列信息，利用 Lasergene7.1 软件分析它们的完整HN 蛋白序列，确定了5 个位置的主要氨基酸种类。 I 西北农林科技大学硕士学位论文 研究表明，5 个氨基酸突变分别位于HN 蛋白的不同位置，这些氨基酸的突变发生在 主要氨基酸之间。 3. HN 突变体蛋白的细胞膜表面表达效率分析 将HN 突变体和野生型质粒转染进BHK21 细胞24 h 后，通过间接免疫荧光（IIFA ） 和流式细胞术（FCM ）对HN 突变体蛋白的表达水平和细胞膜表面表达效率分析后发 现，所有的HN 突变体和野生型蛋白均成功表达，且在细胞膜表面的表达效率没有显 著差异。 4. HN 突变体蛋白的生物活性分析 为了排除病毒增殖能力对膜融合活性的影响，利用融合 PCR 技术构建 5 个 HN 单突变体质粒，将其HN 突变体和野生型质粒分别与F 质粒共转染BHK21 细胞36 h 后，通过ImageJ 软件分别统计它们所产生的40 个合胞体的面积用以比较促膜融合活 性的差异，发现NDV-Blackbird 的HN 蛋白比NDV-Dove 拥有更强的促膜融合能力， 而突变体中T522I 没有影响，G54S、F110L