yRad52、Ad4 E1B55K和Ad4 E4orf6与Cas9共表达、融合表达对HDR效率的影响.pdf

摘要 摘要 CRISPR/Cas9 系统作为新一代基因组编辑工具问世以来，引起了生命科学领域的 狂潮，特别是在哺乳动物细胞中的应用。哺乳动物细胞通过多种途径修复双链断裂 （Double strand break, DSB ），主要包括易错的非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ ）和高保真的同源介导修复（Homology-directed repair, HDR ）途径。通过 CRISPR/Cas9 成DSB 后，主要通过NHEJ 途径进行修复，这种途径易引入随机性的插 入或缺失，是一种不精确的修复方式。在提供与目标基因座同源性的DNA 模板的情况 下，HDR 途径则可以实现精确的基因组编辑。然而，HDR 参与DSB 修复的效率要远 低于NHEJ 。HDR 的低效性仍然是精确基因组编辑技术的瓶颈，如何提高HDR 效率成 为研究者探索的热点。 近年来，科学家们研究出多种策略来提高 HDR 效率，如抑制 NHEJ 通路、强化 HDR 通路、控制细胞周期等，均可在不同程度上提高 HDR 效率。本研究在相关研究 的基础上，成功将酿酒酵母源Rad52 （yRad52 ）、腺病毒4(Ad4) E4orf6 和Ad4 E1B55K 蛋白分别整合在CRISPR/Cas9 系统中，比较了Cas9 蛋白与重组蛋白yRad52 、Ad4 E4orf6 、 Ad4 E1B55K 蛋白共表达策略和融合表达策略对HDR 效率的影响，期望为提高基因组 精确编辑效率提供新的技术手段。 本研究的主要结果如下： 1．为了在报告载体水平上初步验证猜想，设计并构建了HDR 效率检测荧光报告 系统。将构建好的Cas9 与yRad52 蛋白、Ad4 E1B55K 、Ad4 E4orf6 蛋白共表达载体、 融合表达载体分别与报告载体以及供体载体共转染至HEK293T 细胞中，通过流式细胞 仪分析荧光细胞数比较各组细胞 HDR 效率。对流式数据进行统计学分析，结果表明， 在报告载体水平上，融合表达Cas9-Rad52 能够使HDR 效率显著增强约1.5 倍，共表达 Cas9-T2A-E4 使HDR 效率增强约1.4 倍。 2 ．在基因组水平进一步验证结论，将Cas9 与yRad52 蛋白、Ad4 E1B55K 、Ad4 E4orf6 蛋白共表达载体、融合表达载体分别与HDR-USR1 报告载体以及供体载体共转 染HEK293T 细胞，对EMX1 位点进行点编辑，HDR-USR1 是实验室新研发的通用筛 选报告载体，可对HDR 阳性细胞进行筛选富集。酶切结果灰度分析得出，融合表达 Cas9-Rad52 在HEK293T 细胞基因组EMX1 位点HDR 效率为17.1±0.5%，较对照组增 强约2 倍；共表达Cas9-T2A-Rad52 、Cas9-T2A-E1B 的HDR 效率为12.3±0.7% 、12.1±0.7%， 较对照组增强约1.4 倍。 3 ．将Cas9-Rad52 融合表达载体与Ad4 E1B55K 蛋白联合使用，灰度分析结果显 示其HDR 效率为16.3%，较对照组提高3.9 倍，表明在HEK293T 细胞EMX1 位点， I 西北农林科技大学硕士学位论文 yRad52 蛋白与Ad4 E1B55K 蛋白具有协同作用，可进一步提高HDR 精确编辑效率。 总之，Cas9 与yRad52 的共表达、融合表达策略以及Cas9-T2A-E1B 共表达策略均 可以增强哺乳动物细胞基因组中的HDR 效率，其中融合表达Cas9-Rad52 增强效果最 强。并且yRad52 与Ad4 E1B55K 蛋白的联合使用对促进HDR 效率具有协同作用。本 研究为提高HDR 精确编辑效率提供了有效策略，有助于推动基因编辑在基础功能研究、 精准医疗以及动物遗传育种方面的应用。 关键词：CRISPR/Cas9 系统；HDR ；Cas-Rad52 融合表达；Cas9-T2A-E1B 共表达；协同作用 II