奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌转录因子sigB功能研究.pdf

摘 要 摘要 健康养殖是保证家畜健康生长、减少抗生素使用和稳定家畜养殖业经济效益的必 经之路。“促进奶业振兴”是国家重大战略需求，而奶牛乳腺炎是制约奶牛健康养殖、 阻碍奶业发展的主要家畜疾病之一。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）是引起奶牛乳腺炎最主要的病原菌之一， 它具有极强的环境适应能力和抗生素耐受性，并且可以侵入宿主细胞内部，极难根除。 本试验以奶牛乳腺源金黄色葡萄球菌BA01611 为研究对象，利用生物化学与分子生物 学结合的方法，构建转录因子sigB 敲除株和回补株，探究其对金黄色葡萄球菌耐药性 及毒力作用的影响与机制。主要结果如下： （1）成功构建金黄色葡萄球菌sigB 敲除载体和原位回补载体：将穿梭质粒pKZ2 与目的基因 sigB 同源臂连接，构建敲除载体（pKZ2-ΔsigB ）和回补载体 （pKZ2-ΔsigB-comp ），将载体化学转入大肠杆菌，进而通过酶切及测序方法完成对载 体的确证。 （2 ）成功构建金黄色葡萄球菌sigB 敲除株及原位回补株：将sigB 敲除载体和原 位回补载体分别电转入目标菌 BA01611，利用同源重组原理与载体温敏特性，成功筛 选到金黄色葡萄球菌sigB 敲除株（BA01611-ΔsigB ）及回补株（BA01611-Δ sigB::sigB ）。 （3 ）转录因子sigB 对金黄色葡萄球菌生长、溶血、毒力与耐药性的影响：转录因 子sigB 对金黄色葡萄球菌BA01611 生长能力及溶血能力均无显著影响 （P ＞0.05 ）； sigB 敲除后丧失金黄色素产生能力，将sigB 基因回补后该菌株金黄色素产生能力可恢 复到野生型水平；在固体琼脂平板梯度稀释生长条件下，sigB 敲除菌株在含有氯霉素 (9.8 μg/ml)、环丙沙星 （12 μg/ml）、头孢唑林 （40 μg/ml ）、苯唑西林 （16 μg/ml）、 盘尼西林 （7 μg/ml）、替考拉宁 （0.25 μg/ml ）和万古霉素 （0.6 μg/ml）7 种抗生素的 培养基中生长能力比野生型减少2-4 个梯度，回补菌株生长能力可恢复到野生型水平； 在液体培养条件下，sigB 敲除菌株在含有头孢唑林 （6 μg/ml ）、苯唑西林（15 μg/ml ）、 替考拉宁 （0.8 μg/ml ）和万古霉素 （1 μg/ml ）4 种抗生素培养基中对抗生素的耐受性相 比野生型减弱。 （4 ）转录因子sigB 影响金黄色葡萄球菌耐药性机制初探：Trition X-100 诱导自溶 试验结果表明sigB 会影响金黄色葡萄球菌BA01611 细胞壁翻转，sigB 敲除株自溶率显 著高于野生菌株和回补菌株 （P ＜0.0 1）；qRT-PCR 结果表明sigB 基因的敲除会使编码 β- 内酰胺酶的基因blaZ 及fstQ ，fstW ，fstY ，fstZ 这四个与细胞分裂相关基因在mRNA 水平的表达量显著降低 （P ＜0.05）。 综上所述，本研究成功构建sigB 基因敲除株和原位回补株，并探究sigB 对金黄色 I 西北农林科技大学硕士学位论文 葡萄球菌耐药及毒力的影响。尽管敲除sigB 并没有导致金黄色葡萄球菌生长和溶血方 面表型的显著改变，但sigB 敲除后细菌丧失金黄色素产生能力，且对多种抗生素耐受 性降低。此外，sigB 敲除会使金黄色葡萄球菌Trition X- 100 诱导的自溶活性显著升高， 基因blaZ 及fstQ ，fstW ，fstY ，fstZ 的表达量显著下降。 关键词：奶牛乳腺炎；金黄色葡萄球菌；基因敲除；sigB II 目 录 目录 摘要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1 健康养殖 1