外泌体在小反刍兽疫病毒传播过程中的作用及其机制研究.pdf

摘 要 摘 要 小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR ）是由小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus ，PPRV ）引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病。PPR 主要侵害绵 羊、山羊等小反刍动物，以口炎、肺炎和发热为主要特征，该病严重阻碍了羊养殖业的 发展。外泌体(exosomes)是一类介导细胞间通讯的纳米级囊泡，可通过其载荷的蛋白质、 核酸、脂类等物质调节摄取这些外泌体的细胞的生物学活性。近年研究表明，外泌体介 导的病毒逃逸或宿主免疫系统抑制可能是病毒传播以及致病的一条关键途径。我们的 前期研究证明，PPRV 感染引起山羊外周血单个核细胞（PBMCs ）外泌体释放水平上升， 提示外泌体在 PPRV 在细胞间传播中发挥作用。本研究旨在揭示 PPRV 感染诱导的外 泌体在病毒传播中的作用及其机制，研究内容及结果如下： 1. 将PPRV 疫苗弱毒 （N75/ 1 株）感染非洲绿猴肾细胞（Vero ）及山羊PBMCs 后 收集上清，通过低速离心除去死细胞、细胞成分和细胞碎片后，结合过滤技术除去游离 的病毒粒子，超高速离心沉淀外泌体，最后用外泌体提取试剂盒富集纯化外泌体。通过 纳米粒子追踪术 （NTA ）、透射电镜、Western blot 技术鉴定提取的外泌体的纯度，NTA 结果表明提取的囊泡在约100nm 处出现峰值，符合外泌体大小；透射电镜下观察到典 型的茶托样囊泡形状；Western blot 检测到外泌体标志蛋白CD63 和CD81 。以上结果表 明分离出高纯度的山羊PBMCs 和Vero 细胞源外泌体。同时NTA、流式细胞术和Western blot 检测结果均表明PPRV 感染可诱导上述细胞外泌体分泌水平显著升高。 2. PPRV 感染Vero 细胞后从上清中提取外泌体，与受体细胞（正常Vero 细胞）共 孵育72 h 后，检测受体细胞中病毒增殖水平。激光共聚焦检测结果表明PPRV 感染的 对照细胞和与感染源外泌体共孵育的受体细胞中均可见大量PPRV 阳染细胞；Western blot 检测表明受体细胞中PPRV-N 蛋白表达水平略低于PPRV 感染对照细胞，但表达水 平差异不显著；TCID50 检测结果表明受体细胞中病毒滴度与PPRV 感染对照组细胞中 病毒滴度无显著差异。进一步用不同浓度 GW4869 （外泌体抑制剂）预处理细胞 24 h 后接种PPRV ，48 h 后提取外泌体并与受体细胞 （正常细胞）共孵育72 h ，Western blot 和TCID50 检测结果表明：随着GW4869 浓度的升高，受体细胞中病毒复制水平和病毒 滴度呈现递减的趋势。以上结果表明，PPRV 感染细胞源外泌体可以荷载感染性病毒核 酸在未感染细胞中建立增殖性感染。 3. 鉴于病毒感染诱导的自噬与外泌体分泌之间的互作关系，本研究进一步检测 PPRV 诱导自噬对外泌体分泌水平的影响。利用自噬诱导剂雷帕霉素 （Rapamycin ）处 理细胞后，对自噬水平和外泌体分泌水平进行检测。Western blot 检测结果表明，相较 I 西北农林科技大学硕士学位论文 于对照组，雷帕霉素能够显著诱导细胞中自噬标志分子LC3- Ⅱ的表达水平以及培养上 清液中外泌体标志分子CD63 的表达水平；激光共聚焦和NTA 检测同样明确了该结果。 进一步将从PPRV 感染且雷帕霉素处理的细胞培养上清中提取的外泌体与受体细胞（正 常细胞）进行共培养，检测受体细胞中PPRV 复制水平。结果表明：相较于PPRV 感染 对照组，PPRV 感染且雷帕霉素处理增强了受体细胞中PPRV 的复制水平。为了更加深 入地分析PPRV 感染后诱导的自噬对外泌体分泌的影响，将干扰自噬相关分子（ATG7 和 Beclin-1）的shRNA 转染细胞后接种 PPRV ，检测外泌体的分泌水平以及病毒的释 放水平，结果表明通过干扰 ATG7 抑制自噬后，显著抑制了外泌体的分泌水平以及依 赖于外泌体途径的病毒释放水平。 4. 鉴于 TSG101 在外泌体分选荷载内容物中发挥重要作用，为确定 TSG101 在 PPRV 感染过程中对外泌体依赖性病毒释放途径的影响，首先将PPR