小反刍兽疫病毒通过miR-3靶向IRAK1抑制Ⅰ型干扰素反应.pdf

摘要 摘要 小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants ，PPR ）是由小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus ，PPRV ）引起山羊、绵羊等小反刍动物的一种急性、烈性和高度接触 性传染病。PPRV 具有较强的淋巴细胞嗜性，感染宿主后造成机体免疫抑制是 PPRV 的主要致病特征。白介素 1 受体相关激酶 1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)是 TLR 信号通路及干扰素信号通路中的关键分子，参与机体抗病毒反应。 MicroRNA 是一类仅有18~25 个核苷酸的单链小分子RNA ，在宿主抗病毒反应中发挥 重要的调控作用。目前，PPRV 感染引起机体免疫抑制过程中miRNA 起何作用尚不清 楚。本研究中，利用 PPRV 感染山羊外周血单个核细胞（PBMCs ）后，根据miRNA 高通量测序结果，从中筛选出与Ⅰ型干扰素通路密切相关的miR-3，进一步探究miR-3 在PPRV 感染引起机体免疫抑制中的作用及其机制，本研究内容和结果如下： 1.检测 PPRV 不同感染剂量 （MOI=0.1 、1、10）和不同感染时间对山羊 PBMCs 中miR-3 表达水平的影响，qRT-PCR 技术检测结果表明：miR-3 表达量随着病毒感染 剂量增加而升高，随着感染时间延长而升高。分别将含有病毒N 、H 、M 、F 、C 和V 基因的质粒转染PBMCs 后，qRT-PCR 检测结果表明：转染V 蛋白能够显著增加miR-3 表达水平。为进一步明确调控miR-3 的转录因子，用不同关键信号分子抑制剂处理山 羊PBMCs 1 h 后感染PPRV（MOI=1 ），qRT-PCR 检测结果表明：PPRV 感染山羊PBMCs 后主要通过NF-κB 及P38 通路上调miR-3 表达。 2. 为进一步探究 miR-3 在 PPRV 复制中的作用，将不同浓度的 miR-3 mimic/inhibitor 及其相应对照转染山羊PBMCs ，转染48 h 后感染PPRV 并检测病毒增 殖水平，Western blot 及 TCID50 检测结果表明：miR-3 能够显著增强 PPRV 在山羊 PBMCs 中的复制水平以及病毒滴度，且呈剂量依赖性。 3.为了探究miR-3 对PPRV 复制水平调控的作用机制，利用多个生物信息学软件 对miR-3 和宿主细胞内的靶基因进行了预测，结果表明：miR-3 与IRAK1 mRNA 的 3UTR 互补结合。双荧光素酶报告基因试验进一步表明miR-3 可直接靶向IRAK1 基因 的3UTR 。分别转染不同剂量的miR-3 mimic/inhibitor 及其对照，qRT-PCR 及Western blot 检测结果表明：miR-3 能够显著抑制靶基因IRAK1 的转录水平及蛋白表达，进一 步研究表明：miR-3 主要通过靶向IRAK1 抑制IRAK1-NF-κB 途径介导的IFN-α 的产 生。 4.转染miR-3 inhibitor 及其对照至山羊PBMCs ，研究不同转染时间对PPRV 复制 水平以及对 IFN-α 和干扰素刺激基因（ISGs ）表达的影响，结果表明：相较于转染对 I 西北农林科技大学硕士学位论文 照组，转染miR-3 inhibitor 能够显著促进IFN-α 和ISGs 的表达水平，而抑制病毒复制 水平和病毒滴度。同时，敲低IRAK1 的表达则对上述病毒复制水平和病毒滴度具有“拯 救”作用。为明确IFN-α 对PPRV 复制的影响，将miR-3 mimic 转染细胞用PPRV 感 染后与重组IFN-α 共孵育，结果显示：IFN-α 处理组ISGs 的表达水平显著增加，转染 miR-3 mimic 促进病毒复制的能力可通过重组IFN-α 的处理而显著降低。以上结果表明， PPRV 感染后诱导的miR-3 主要通过抑制IFN-α 表达水平来促进病毒复制。此外，基于 si-IRF3 干扰IRF3 表达发现，PPRV 感染PBMCs 后ISGs 能够通过IRF3 途径生