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Western blot
试剂配制
1. 30% 丙稀酰胺储存液
丙稀酰胺 29g
N, N’-亚甲双丙稀酰胺 1g
双蒸水定容到 100ml ,
经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光, 4℃保存于棕色瓶中
2. 1.5
M Tris-HCl (MW=121.1)
pH 8.8
Tris 碱
90.75g
双蒸水
400ml
用浓 HCl 调 pH 至 8.8,加双蒸水定容至
500ml。 4℃冰箱保存
3. 1.0
M Tris pH6.8
Tris 碱
12g
双蒸水
60ml
用浓 HCl 调 pH 至 6.8,
加双蒸水定容至 100ml 。 4℃冰箱保存
4. 10% SDS(w/v )
SDS 10g
溶于加水至 100ml ,室温放置
5. 10% 过硫酸胺( 10%APS )
过硫酸胺 1g
溶于 10ml 双蒸水中。可在密闭的管子里 4℃保存一周
6. 10× Tris- 甘氨酸电泳缓冲液
Tris 30.3g
甘氨酸 144g
SDS 10g
定容至 1000ml 室温 放置。
临用时稀释成 1×电泳缓冲液
7. 1%溴酚蓝( w/v )
溴酚蓝
100 mg
Tris-base
60 mg
MilliQ 水
定容至 10 ml
8. TEMED 原液, 4℃冰箱保存
9. 2× sample buffer(2 ×样品缓冲液 )
1.0 M Tris pH6.8
2.5ml
SDS
0.8g
DTT
0.3085g
甘油
3ml
溴酚蓝
0.004g
加双蒸水至 10ml ,分装— 20℃保存
10. 4× SDS 加样缓冲液 10ml
1M Tris-HCl(ph:6.8)
2.5ml
SDS
0.8g
溴酚蓝
0.004g
甘油
4ml
Takara
5x buffer
总 5ml
1M Tris-HCl(ph:6.8)
1.25ml
SDS
0.5g
溴酚蓝 BPB
25mg
甘油
2.5ml
500ul 每管分装,使用前将
25ul 的 2-ME 加到没管中
11.转膜缓冲液
Tris
碱
5.8g
甘氨酸
2.9g
SDS
0.37g
甲醇
200ml
加双蒸水至 1000ml ,临用前配制, 4℃冷却
12. 1× TBST
Tris 碱
3.0285 g
氯化钠 8.766g
Tween-20 500ul
加双蒸水至 1000ml ,现配现用。( 4℃最多保存一周)
13. n%封闭液 (一般 5%)
脱脂奶粉 n 克溶于 100ml 1 × TBST , 4℃冰箱保存
附表 1 配制 Tris- 甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
不同体积( ml)凝胶液中各成分所需体积(
ml )
溶液成分
5
10
15
20
25
30
40
50
6%
水
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
21.2
26.5
30%丙烯酰胺溶液
1
2
3
4
5
6
8
10
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10
12.5
10% SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
8%
水
2.3
4.6
6.9
9.3
11.5
13.9
18.5
23.2
30%丙烯酰胺溶液
1.3
2.7
4
5.3
6.7
8
10.7
13.3
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10
12.5
10% SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.003
0.006
0.009
0.012
0.015
0.018
0.024
0.03
10%
水
1.9
4
5.9
7.9
9.9
11.9
15.9
19.8
30%丙烯酰胺溶液
1.7
3.3
5
6.7
8.3
10
13.3
16.7
1.5 mol/L Tris (pH8.8)
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10
12.5
10% SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
12%
水
1.6
3.3
4.9
6
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