NY_T 4149-2022 动物源大肠埃希菌分离与鉴定技术规程.docx

ICS 67.120.10 CCS X 22 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 NY/T 4149—2022 动物源大肠埃希菌分离与鉴定技术规程 Technical code of practice for isolation and identification of Escherichia coli from animals 2022-07-11 发布 2022-10-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 4149—2022 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口。 本文件起草单位：中国兽医药品监察所、广东省农产品质量安全中心。 本文件主要起草人：张纯萍、吴荔琴、赵琪、刘佩怡、宋立、肖田安、崔明全、伍宏凯、徐士新、刘燕、 王鹤佳。 工 NY/T 4149—2022 动物源大肠埃希菌分离与鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了大肠埃希菌(Escherichia coli)的分离与鉴定方法。 本文件适用于动物直肠/泄殖腔拭子、粪便拭子、肠道内容物拭子等样品中大肠埃希菌的分离和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂或材料 4.1 要求 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682规定的三级水，培养基按附录 A 配制或 用商品化产品。 4.2 试剂 4.2.1 α氰-4-羟基肉桂酸(HCCA): 色谱纯。 4.2.2 甘油 4.3 溶液制备 4.3.1 乳糖发酵管：按照附录A 中 A.1 的规定执行。 4.3.2 Kovacs 靛基质试剂：按照A.2 的规定执行。 4.3.3 甲基红试剂：按照 A.3 的规定执行。 4.3.4 V-P 试剂：按照A.4 的规定执行。 4.3.5 基质溶液：取α氰-4-羟基肉桂酸(HCCA), 按说明书配制；或用市售商品。 4.3.6 灭菌甘油：取甘油适量，121℃灭菌20 min。 4.4 培养基制备 4.4.1 Cary Blair 氏运送培养基：按照 A.5 的规定执行。 4.4.2 麦康凯琼脂：按照A.6 的规定执行。 4.4.3 营养琼脂：按照A.7 的规定执行。 4.4.4 蛋白胨水：按照A.8 的规定执行。 4.4.5 缓冲葡萄糖蛋白胨水：按照A.9 的规定执行。 4.4.6 西蒙氏柠檬酸盐培养基：按照A.10 的规定执行。 4.4.7 5%蔗糖脱脂乳保护剂：按照A.11 的规定执行。 4.5 标准菌株 2 MS)。NY/T 4149—2022 MS)。 大肠埃希菌(Escherichia coli)[ATCC 25922/CMCC(B)44102/CVCC 1570]。 4.6 材料 4.6.1 革兰氏染色套装。 4.6.2 磁珠保藏管 4.6.3 革兰氏阴性细菌鉴定卡(盒)。 5 仪器设备 5.1 pH 计：测量范围pH 0～14,精度为0.02 pH 单位。 5.2恒温培养箱：(36±1)℃,(44.5±0.2)℃。 5.3 冰箱：2℃~4℃,一20℃及以下。 5.4 二级生物安全柜。 5.5 分析天平：感量0.1g. 5.6 显微镜：10×~100×。 5.7高压灭菌锅。 5.8 微生物生化鉴定系统。 5.9微生物质谱仪(MALDI-TOF 6 分离与鉴定流程 大肠埃希菌分离与鉴定流程见图1。 动物直肠/泄殖腔拭子、粪便拭子、肠道内容物拭子等 动物直肠/泄殖腔拭子、粪便拭子、肠道内容物拭子等 接种麦康凯琼脂平板，(36±1)℃培养18h～24h 挑取单个红色菌落，于麦康凯琼脂平板上纯化 接种营养琼脂平板，(36±1)℃培养16h～18h 生化鉴定 微生物质谱鉴定 大肠埃希菌 图1 大肠埃希菌分离与鉴定流程 7 分离纯化