NY_T 4148-2022 动物源弯曲杆菌分离与鉴定技术规程.docx

ICS 67.120.10 CCS X 22 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 NY/T 4148—2022 动物源弯曲杆菌分离与鉴定技术规程 Technical code of practice for isolation and identification of Campylobacter from animals 2022-07-11发布 2022-10-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I NY/T 4148—2022 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口。 本文件起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所。 本文件主要起草人：王娟、张纯萍、曲志娜、赵琪、刘俊辉、黄秀梅、宋立、李雪莲、张青青、李月华、刘娜、 王琳、崔明全、王君玮、王鹤佳、徐士新。 NY/T 4148—2022 动物源弯曲杆菌分离与鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了动物源弯曲杆菌(Campylobacter) 的分离与鉴定方法。 本文件适用于动物直肠/泄殖腔拭子、新鲜粪便、肠道内容物等样品中空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌的 分离和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂或材料 4.1 要求 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的三级水，培养基按附录 A 配制或 用商品化产品。 4.2 试剂 4.2.1 四甲基对苯二胺盐酸盐。 4.2.2 30%过氧化氢。 4.2.3 聚合酶链式反应预混液(2×PCR Master Mix)。 4.2.4 琼脂糖 4.2.5 50×TAE 缓冲液。 4.2.6 α氰-4-羟基肉桂酸(HCCA): 色谱纯。 4.3 溶液配制 4.3.1氧化酶溶液：取四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g,加水适量使溶解，并稀释至100mL。 4.3.2 3%过氧化氢溶液：取30%过氧化氢100mL、水900mL, 混匀。 4.3.3 马尿酸钠水解试剂：按照附录A 中A.1 的规定执行。 4.3.4 1×TAE 缓冲液：取50×TAE 缓冲液20mL, 加水定容至1000mL。 4.3.5 1.2%琼脂糖凝胶：取琼脂糖1.2g 于100mL1×TAE 缓冲液中加热，充分溶解。 4.3.6 基质溶液：取α氰-4-羟基肉桂酸(HCCA), 按说明书配制，或用市售商品。 4.4 培养基制备 4.4.1 Cary-Blair 氏运送培养基：按照 A.2 的规定执行。 4.4.2 Bolton 肉汤：按照 A.3 的规定执行。 4.4.3 改良CCD 琼脂：按照A.4 的规定执行。 4.4.4 Skirrow 血琼脂：按照 A.5 的规定执行。 2 NY/T 4148—2022 4.4.5 弯曲杆菌显色培养基：按说明书配制。 4.4.6 哥伦比亚血琼脂：按照 A.6 的规定执行。 4.4.7 布氏肉汤：按照A.7 的规定执行。 4.4.8 5%蔗糖脱脂乳保护剂：按照A.8 的规定执行。 4.5 标准菌株 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,ATCC 33560)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli, ATCC 43478)。 4.6 材料 4.6.1 吲哚乙酸酯纸片。 4.6.2 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。 4.6.3 磁珠保藏管。 5 器材设备 5.1 二级生物安全柜。 5.2 恒温培养箱。 5.3 冰箱：2℃~5℃,-20℃或以下。 5.4 恒温振荡培养箱。 5.5 分析天平：感量0.01 g。 5.6 高压灭菌器。 5.7 振荡器。 5.8 微需氧培养装置：提供微需氧条件(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气)。 5.9 显微镜：10×~100×。 5.10 高速冷冻离心机。 5.11 麦氏比浊仪。 5.12微生物生化鉴定系统。 5.13 PCR 仪。 5.14核酸电泳仪。 5.15电泳凝胶成像分析系