- 1、本文档共14页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
细胞免疫组化
细胞爬片的免疫组化
细胞爬片,5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。
PBS 清洗标本 3 次 各 1 min。
3 .冰丙酮固定 15 min(或 4%多聚甲醛固定 30min)。
空气干燥 5min。
PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。
0.5%Triton X-100( DPBS 配 ) 孵育 1 次 20min。
PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。
8 .3%H2O2(试剂 A)孵育 15 min。
DPBS 清洗标本 3 次 各 2 min。
封闭血清孵育(试剂 B) 20min。
11 .一抗孵育(滴度 1:200,湿盒)4℃ 过夜或 37℃60 min。阴性对照最好用一抗来源血清,否则用 PBS 液
12. PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。
.二抗工作液孵育(湿盒试剂 C) 37℃30 min。
.PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。
15. 试剂 D(湿盒) 37℃ 30 min。16、PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。
17、DAB 显色(避光,镜下观察至棕色 ) 约 3~10min。
18、蒸馏水洗 2 次 1 min。
19、苏木素复染 0.5~1min。
20、自来水洗返蓝。
——仅供参考
——仅供参考
——仅供参考
21.梯度酒精脱水 75,85,95,100%各 3min。
22.二甲苯透明 2 次 3min。
23、中性树胶封片。注意事项:
1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础,要获得良好细胞爬片须 注意以下:
a 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达 5 天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片;
b 接种的细胞密度适中以 2*104/ml 为宜,若密度太高 5 天后细胞连接成片冲洗时易脱片;
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于 4C 冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩, 可用 80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿,(不可用吸管太用力吹,易脱片)
4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜
5、Triton X-100 表面活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使 其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做?
如果不看荧光,两种都可以,感觉粘好了再做要快一些,但是做的时候 要防止脱落。
如果看荧光,就不能用中性树胶粘,直接在 24 孔,或 6 孔板里做才可以。中性树胶要折光,散射的光干扰,没办法看细胞本身的荧光。
孔板里做免疫组化较方便,细胞比盖玻片易贴壁,但染色后不能用二甲 苯透明、封片(可用甘油)。
细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能,只有开始就让细胞贴在玻片上爬 片。
我没有在多孔板里做过,其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦,偶这 样做很少掉片。
先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上,由于液体的表面张力,细胞悬 液一般不会流淌到盖玻片外面,等细胞大概贴壁后,不同细胞贴壁时间稍 有不同,大概 6、7 个小时,差不多贴壁再加生长液,开始滴的细胞的数量你要摸索一下,到固定时细胞生长到 80%左右比较合适。
偶是在盖玻片上做的, 首先细胞要爬的匀一些,象 dongwp 战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后,用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。 擦干盖玻片的背面,在玻片背面四周涂一点凡士林,粘贴于载玻片上,这一点很重要,在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。
细胞爬片的保存和抗原修复问题总结
细胞爬片可以用 含 叠氮钠 PBS 液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!!
0.04--0.08%。但是我
建议对于细胞爬片,还是尽量快的进行处理,以防不必要的问题!
louischen wrote:但我的细胞爬片经过 4%多聚甲醛固定,PBS 冲洗后直接就放在了-20 度,还能用于免疫组化吗?!
mRNA 原位杂交经 4%多聚甲醛固定,固定液需加 DEPC 水。其它建议用甲醇固定。-20 度保存
如果是 4%多聚甲醛固定,然后放在 PBS 中保存,在 4 度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。
丙酮中固定 5-10 分钟,然后风干,放置4 度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜,蛋白质固定过度,会影响抗原的暴露,影响免疫组 化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果,可考虑应用 0.5%的triton-100 孵育 30 分钟,渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理,不要用其他抗原修复的方法,会造成掉片,我曾有过这方面的体会
丙酮固定后,PBS 洗涤 3 次,即可保存至 4 度冰箱备用。
(1)细胞爬片先用 TBS 洗 3 次,每次 5 分钟(2)4%多聚甲醛固定,室温,20 分钟
(3)7
文档评论(0)