细胞融合与体细胞杂交.pptVIP

四 细胞融合原理 1细胞膜的结构与功能 细胞膜磷脂分子 扰动出现通道 ——细胞桥 当前第31页\共有84页\编于星期四\21点 主要环节 （1）亲本选择（单细胞或原生质体制备） （2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附 （3）质膜融合形成细胞桥 P133 图7.4 （4）胞质渗透 （5）细胞核融合 （6）融合细胞筛选 当前第32页\共有84页\编于星期四\21点 原生质体及其制备 （1）定义： 去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体 （protoplast）。 （2）特点： 无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变 、细胞器转移、细胞融合等操作。 具有全能性，能再生细胞壁。 当前第33页\共有84页\编于星期四\21点 （ 3）制备与纯化 酶解法的建立 1960年，英国科金第一次采用 酶方法从番茄幼苗大量制备出 原生质体。使植物细胞融合技 术得以建立。 植物细胞的细胞壁主要成分是 纤维素（纤维素微纤丝 Cellulose microfibrils ）、 果胶（pectin）、多糖 （glycan）。 果胶酶、纤维素酶等处理植物 组织，可以破坏胞间层和去掉 细胞的纤维素外壁，得到游离 的裸露原生质体。 当前第34页\共有84页\编于星期四\21点 4 分离 分离方法 飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 离心法：低速离心，收集沉淀。 结合法：先低速离心，再漂浮 Percoll分层液:是经过聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。 当前第35页\共有84页\编于星期四\21点 关键： 细胞核的融合 若是没发生细胞核的融合，仅发 生了细胞质的融合，则可能成为 嵌合细胞。 含有多个核的异核细胞合并后形 成的单核细胞称为合核细胞。 细胞核的合并发生在有丝分裂过 程中。但是这种有丝分裂只有当 两个核的DNA合成基本同步时才 能发生：两个核同时进行有丝分 裂，形成一个纺锤体，全部染色 体都排列在一个赤道板上，结果 伴随着细胞分裂就形成了单核的 子细胞，其细胞核中含有双亲细 胞的染色体。 当前第36页\共有84页\编于星期四\21点 五 细胞融合方法 1.生物法 病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于 病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个 细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。 原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某 些糖蛋白有促进细胞融合的功能。 仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒（ HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因 HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。 缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用， 操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与 亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。 当前第37页\共有84页\编于星期四\21点 原理与过程 （1）足够量的病毒颗粒附着在 细胞膜上起搭桥作用，使细胞 聚集在一起。 （2）通过病毒与原生质体或细 胞膜的作用使两个细胞膜间互 相渗透，胞质互相融合。粘结 部位质膜被破坏，不同细胞间 形成通道，细胞质流通并融合 （病毒也随之进入细胞质）。 （3）有丝分裂，细胞核融合， 形成杂种细胞。 当前第38页\共有84页\编于星期四\21点 2化学法 可以采用的化学诱导剂包 括： NaNO3、高pH的高浓度Ca2+ 离子、聚乙二醇（PEG） 、溶菌酶、明胶、抗体、 植物凝血素伴刀豆球蛋白 A等。 细胞膜电荷平衡被打破。 当前第39页\共有84页\编于星期四\21点 （ 1） NaNO3诱导融合 1909年，凯斯特（Kuster）发现机械分离的发生 了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶 液中可以恢复并伴随着细胞融合。 1972年，卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融 合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界 第一株体细胞杂种。 NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷， 引起原生质体聚集，促进细胞融合。NaNO3对原 生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%。 当前第40页\共有84页\编于星期四\21点 （ 2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合 1973年，凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers） 发现采用强碱性（例如pH10.5）的高浓度钙离子溶 液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下处理两个品系 的烟草叶肉原生质体，很容易促使融合，融合率可 以达到10%。 钙离子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷，使 彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH 能