SN_T 2728-2010枯草芽孢杆菌检测鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2728-2010枯草芽孢杆菌检测鉴定方法Detection and identification of Bacillus subtilis2011-05-01实施2010-11-01发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2728—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王芳、王金玲、张莹、马骏、王涛、孟祥勇、林颍、耿庆华、李成、雷质文。 SN/T 2728--2010枯草芽孢杆菌检测鉴定方法1范围本标准规定了枯草芽孢杆菌的形态学鉴定、生化鉴定以及PCR、荧光 PCR检测鉴定方法。本标准适用于枯草芽孢杆菌检测鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本使用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489　实验室　生物安全通用要求WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1枯草芽孢杆菌Bacillus subtit革兰氏阳性杆菌,芽孢杆菌科,芽孢杆菌属,内生孢子,接触酶阳性，发酵葡萄糖产酸,水解淀粉,不水解马尿酸盐，可还原硝酸盐，水解酪素,在55/℃可生长的一群芽孢菌。4　人员防护为了保护实验室人员的安全;应由具备资格的工作人员检测，所有培养物应小心处置。在对微生物级防护的规定执行。菌剂的取样和检测过程中,按照GB19489中的生物二5主要试剂和培养基除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水应符合 GB/T 6682。所有试剂均用无 DNA酶污染的容器分装。5.1营养琼脂：蛋白陈10g，牛肉浸膏3.0g,氯化钠5.0g,琼脂15.0g，1L蒸馏水，加热煮沸到完全溶解,调节 pH 7.3±0.1,121℃灭菌15min。5.2营养肉汤：蛋白陈10g，牛肉浸膏 3.0g,氯化钠5.0g,1L蒸馏水，加热煮沸到完全溶解，调节 pH7.3±0.1,121℃灭菌15min。5.3 TE 缓冲液:10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH8.0。5.410XPCR缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),500 mmol/L 氯化钾(KCl),15 mmol/L氯化镁(MgCl2)。5.5 TBE:54 g Tris ,27.5 g 硼酸,800 mL 去离子水溶解,20 mL 0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)定容至 1 L。1 SN/T 2728—20106生要仪器和设备6.1天平：精度为0.1g。6.2恒温培养箱：30℃±1℃。6.3恒温水浴锅。6.4离心机：转数12 000 r/min以上。6.5 PCR 仪。6.6荧光PCR仪。6.7微量移液器和灭菌吸头：10 μL、20 μL、200 μL、1000μL。样品制备、培养以无菌操作将检样25g(mL)用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲溶液做成10-1～10-10的稀释液，充分混匀。选择适宜的2个～3个连续稀释度的菌液1mL于灭菌平皿内，将冷却到40℃～50℃的营养琼脂倒人平血，轻轻混勾，制成混板，每个稀释度做两个平行样。待培养基凝固后倒置于30℃士1℃恒温培养箱内培养24 h～48 h。挑取平板上3个～5个无色透明菌落进行形态学鉴定并挑单菌落转营养肉汤30℃士1℃恒温培养箱内增菌培养18h～24 h后进行生化鉴定。8形态学及生化鉴定8.1革兰氏及芽孢染色将第7章中平板上的菌落做涂片进行革兰氏和芽孢染色，镜检。8.2生化鉴定法取菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每管100μL。8.3枯草芽孢杆菌形态学及生化特征枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性杆状细菌,细胞直径1 μum,很少成链，鞭毛侧生，内生孢子,芽孢不膨大，不形成伴孢晶体。生化特征见表1。表1枯草芽孢杆菌生化特征鉴定项目枯草芽孢杆菌接触酶+氧化酶厌氧生长VP试验+VPpH6-一十VPpH7:甲基红试验+葡萄糖:12 SN/T 2728-—2010表1 (续)鉴定项目枯草芽孢杆菌+木糖+L-阿拉伯糖甘露醇→利用葡萄糖产气利用柠檬酸盐+硝酸盐还原50℃生长XpH5.7生长7%氯化钠生长+淀粉水解明胶液化+分解酪素注：“十”为反应阳性；“二”为反应阴性；“十或“-/十”为反应不定。9PCR 检测鉴定方法9.1细菌模板DNA的提取9.1.1蛋白酶水解提取法取上述培养的增菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清液，