SN_T 3932-2014出口食品中蜡样芽孢杆菌快速检测方法 实时荧光定量PCR法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3932—2014出口食品中蜡样芽孢杆菌快速检测方法实时荧光定量PCR法Rapid detection of Bacillus Cereus for export foods-Real-time PCR method2014-11-01实施2014-04-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局梦铺 SN/T 3932--2014前言本标准依照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海交通大学、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准起草人：杨捷琳、施春雷、谌鸿超、曾宪东、杨柳、贾俊涛、何宇平、潘良文、张继伦、姜英辉。I SN/T 3932---2014出口食品中蜡样芽孢杆菌快速检测方法实时荧光定量PCR法范围本标准规定了出口食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光定量PCR检测方法。本标准适用于出口食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.141食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验3测定方法3.1方法提要本标准采用锁核苷酸（LNA)探针特异性检测蜡样芽孢杆菌。该探针利用了单核苷酸多态性(SNP,Single Nucleotide Polymorphism)的原理，利用蜡样芽孢杆菌区别于其他种芽孢杆菌的特异位点进行检测。3.2试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为无菌双蒸水。3.2.1 引物:5-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-35-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-33.2.2锁核苷酸(LNA)探针：FAM-5-FAM-TGTAAT* GG* TTGTT* CG*CAA-BHQ1-3注：*表示该位点为锁核苷酸位点。3.2.3Taq DNA 聚合酶。3.2.4dNTP:dATP、dTTP,dCTP、dGTP3.2.5DNA 提取试剂:0.1% Chelex 100 水溶液。3.2.610XPCR缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4),200 mmol/L 氯化钾,15 mmol/L氯化镁。LB培养基：称取酪蛋白陈10g,酵母提取物 5g,NaCl 10 g,溶于 1 L 水中,调节:pH值至 7.0,高3.2.7压灭菌。3.2.8蜡样芽孢杆菌质控菌株：ATCC14579或等效菌株。3.3仪器和设备3.3.1荧光PCR仪。3.3.2离心机:20 000 r/min。 SN/T 3932---20143.3.3移液器:2.5 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL。3.3.4水浴锅。3.4检验步骤3.4.1增菌冷冻样品应在 45℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过 18 h 解冻,若不能及时检验，,应放于一18℃左右保存;非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存,24 h 内检验。称取样品25g，放人盛有225mLLB培养基（见3.2.7)的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000 r/min～10 000 r/min 均质1.min～2_min，或放人盛有 225 mL LB培养基的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min～2mi，若梓品为液态，吸敢25mL样品至盛有225mLLB培养基的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中：振荡混匀，作为1：10的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品萄液（液体样品可包括原液)30℃±1℃，培养9h～18h。3.4.2模板DNA准备每瓶培养的菌液分别取1mL加到.1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸弃上清；加入 50 μL TE溶液及终浓度为3-mg/mL的溶菌酶，室温孵育 10.min，孵育完毕后沸水浴5min（也可以采用等效的核酸提取试剂盒提取DNA12.000r/min离心5 min，取上清液以待检验（如不能及时检验，可将上清液于-20℃保存）。3.4.3荧光 PCR 检测反应体系总体积为25μL,其中含:10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、引物对(10 μmol/L)各 1 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5L探针(2-μmol/L)1 μL、水 15.5 μL、模板 DNA2.5μL。反应条件：95℃10mi9515 s，60℃1min,60℃时收集FAM荧光，共进行40个循环。反应产物可在4℃保存