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survilinmrna及hpv1618与宫颈癌的相关性研究 肿瘤的发生、发展和恶化是一个多基因、多因素、多阶段的过程。研究表明,宫颈癌的发生、发展与人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染和细胞凋亡的调控有密切关系。Bcl-2基因是最早发现的细胞凋亡抑制基因,是迄今研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一;而Survivin是至今发现抗凋亡作用最强的基因。本研究采用原位杂交法在核酸水平检测正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌中Survivin mRNA及HPV16/18 DNA的表达,同时采用免疫组化法在蛋白水平检测Bcl-2的表达。研究Survivin基因在宫颈癌中的表达及与Bcl-2、HPV16/18的相互关系,探讨三者与宫颈癌的相关性。 1 数据和方法 1.1 病例对照分析 收集2006年1月至2008年3月因CIN或宫颈癌在我院就诊患者的病理标本155例,临床资料均较完整。其中CIN组74例(CINⅠ级13例,CINⅡ级26例,CINⅢ级35例),宫颈癌组81例(70例鳞癌,11例腺癌);另取20例正常宫颈组织(包括宫颈良性病变)作对照组。根据2000年国际妇产科联盟(FIGO)分期标准进行宫颈癌临床分期:ⅠA期9例,ⅠB期17例,ⅡA期33例,ⅡB期12例,Ⅲ期10例。按组织病理学分级:高分化14例,中分化29例,低分化38例。按照肿瘤生长类型分为:外生型39例,内生型15例,溃疡型16 例,颈管型11例。81例宫颈癌患者中54例行广泛性子宫切除术加盆腔淋巴结清扫术(包括ⅠA期3例、ⅠB期17例、ⅡA期33例、ⅡB期1例),有淋巴结转移者21例,无转移者33例。患者年龄19~78岁,平均40.06岁。取材前均未接受任何其他治疗。 1.2 ccrtcacdacca基因回复性分析 Survivin原位杂交检测试剂盒(购于武汉博士德生物技术有限公司),针对人Survivin靶基因的mRNA引物序列为:①5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCA-3′;②5′-AAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCT-3′;③5′-AGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGG-3′。HPV 16/18原位杂交试剂盒(购于福建泰普生物科学有限公司),鼠抗人Bcl-2多克隆抗体和免疫组化试剂盒(即用型二步法)(购自北京中杉生物技术公司)。 1.3 方法 1.3.1 样品处理 所有标本及时以4%多聚甲醛(含有1/1000DEPC)固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。 1.3.2 msna核酸片段的制备 切片脱蜡脱水,滴加新鲜配置的0.5%H2O2,室温处理30分钟;滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶,37℃消化以暴露Survivin mRNA核酸片段;滴加预杂交液,恒温箱恒温42℃4小时;滴加杂交液,恒温箱42℃过夜;梯度SSC洗涤,依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC,DAB显色、复染、透明,封片镜检。以不加Survivin探针只加预杂交液作为阴性对照。 1.3.3 免疫总免疫法检测人单克隆抗体 采用免疫组织化学染色 (即用型二步法):石蜡包埋组织切片常规脱蜡脱水后,微波修复抗原,经内源性过氧化酶(3%H2O2)阻断剂孵育10分钟,PBS液冲洗。加Bcl-2鼠抗人单克隆抗体(稀释度1∶50),4℃冰箱过夜。PBS冲洗后加入即用型二抗PV-6000,37℃孵育20分钟,PBS冲洗,常规DAB显色,苏木素复染、透明,封片镜检。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,用已知阳性片作阳性对照。所有切片均在相同条件下进行。 1.3.4 生物素化探针 切片脱蜡水化,加蛋白酶K,37℃孵育18分钟;梯度酒精脱水。每张切片加入10μl的生物素化探针,并盖上盖玻片。95℃变性10分钟,37℃下湿盒中杂交10小时,去垢剂洗涤液浸片15分钟去盖玻片。加SPAP结合物,37℃孵育25分钟,加酶底物BCIP/NBT室温暗盒显色15分钟。核固红复染,水性封片剂封片。 1.3.5 阳性细胞数法检测 所有切片采用双盲法由两位有经验的病理科医师阅片。参照Kawasaki等的半定量积分法判断结果:光镜下,Survivin和Bcl-2阳性表现为细胞浆中出现淡黄色至棕黄色颗粒。随机观察10个高倍镜视野,按每高倍镜视野阳性细胞数百分比记分:阳性细胞数小于5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,大于75%为4分。按着色强度记分:染色呈淡黄色者记为1分,染色呈黄色者记为2分,染色呈棕黄色者记为3分。两种记分的乘积即为阳性强度:0分为阴性(-),1~4分为弱阳性(+),5~8分为中度阳性(++),9~12分为强阳性(+++)。HPV 16/18 DNA阳性细胞表