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NY-ESO-1抗原T细胞受体基因慢病毒载体的构建及病毒的产生与鉴定的开题报告

1.研究背景及意义

肿瘤治疗中，免疫治疗作为一种新兴的治疗方法，已经逐渐成为研究的热点。NY-ESO-1抗原是一种在许多肿瘤中高表达的癌胚抗原，对于免疫治疗来说是一个极具吸引力的靶点。近年来，CAR-T细胞治疗已成为临床上最具前景的免疫治疗方法之一，然而由于CAR-T细胞治疗的不足，诱导T细胞的治疗方法才是公认的较优解决方案，因此在T细胞治疗的探索中，T细胞受体（TCR）基因重组技术也是免疫治疗的重要研究方向之一。

2.研究内容及方向

本研究将以NY-ESO-1抗原为靶点，设计构建基于TCR技术的治疗系统。利用慢病毒作为载体，将NY-ESO-1抗原特异性TCR基因转染至人外周血T细胞中，目的是诱导T细胞的特异性杀伤肿瘤细胞。本研究包括以下方面：

（1）获取NY-ESO-1特异性TCR基因序列；

（2）设计基因重组克隆，构建NY-ESO-1抗原T细胞受体基因；

（3）将T细胞受体基因连接到慢病毒载体中；

（4）将慢病毒载体转染到恒河猴肾细胞中，制备病毒；

（5）检测病毒的纯度和活性的；

（6）利用脂质体介导转染法将NY-ESO-1抗原特异性TCR基因转染在外周血T细胞中；

（7）检测转染后的T细胞表达和功能。

3.研究方法及技术路线

（1）获取NY-ESO-1特异性TCR基因序列：利用PCR技术在NY-ESO-1抗原特异性T细胞中扩增TCR基因。

（2）设计基因重组克隆，构建NY-ESO-1抗原T细胞受体基因：选取合适的TCRV和J基因段，将CD3ζ链与TCRV和J链相连构建完成整个NY-ESO-1抗原特异性TCR基因。

（3）将T细胞受体基因连接到慢病毒载体中：利用限制性内切酶将NY-ESO-1抗原特异性TCR基因与慢病毒载体连接。

（4）将慢病毒载体转染到恒河猴肾细胞中，制备病毒：将慢病毒载体转染至恒河猴肾细胞中，培养12~48h后采集病毒。

（5）检测病毒的纯度和活性：通过表面过表达NY-ESO-1抗原的细胞株进行感染实验，利用流式细胞仪检测病毒感染率和感染细胞的TCR表达情况，从而判断病毒的纯度和活性。

（6）利用脂质体介导转染法将NY-ESO-1抗原特异性TCR基因转染在外周血T细胞中：利用脂质体将NY-ESO-1抗原特异性TCR基因转染在外周血T细胞中。

（7）检测转染后的T细胞表达和功能：采用荧光定量PCR和流式细胞仪检测转染后T细胞的TCR表达水平和功能，包括特异性杀伤肿瘤细胞的能力等。

4.预期结果及意义

本研究预期通过设计构建基于TCR技术的治疗系统，实现对NY-ESO-1抗原高度特异的T细胞的特异性杀伤肿瘤细胞的目的，从而为免疫治疗肿瘤提供一种新的治疗策略，同时也对NY-ESO-1抗原特异性TCR基因的研究提供了实验基础。