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动物转基因方法简介

转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。

原核显微注射法（原核期细胞：受精卵的两个核未融合时期的细胞）

目前最常用的转基因动物生产方法，又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。其创始人是Jaenisch和Mintz等。Gordon等和Palmiter等先后通过此方法获得转基因动物。此方法目前应用较普遍，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。王敏华(1996)报道用显微注射法转移抗瘟病毒核酸酶基因，获得了转基因兔。KrimPenfort运用体外培养胚胎再施用显微注射法获得了转基因牛

这种方法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因。它可以直接获得纯系（应该也不一定，如上述鱼的情况），所以实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死

外源基因整合到受体基因组的时机，将决定转基因动物是否发育成嵌合体，如整合发生在第一次卵裂前，即发生在DNA合成的S期，外源基因将随染色体的分离均匀的分布到每一个细胞，得到的转基因动物是纯合体，反之，得到的将是嵌合体。显微注射转基因的实践证明，受精卵DNA合成的S期是显微注射的适宜时机。但由于整合需要一段时间，等目的基因整合至染色体后，受精卵早已分裂多次，故很难得到纯合体。如鱼类在原肠胚早期才开始整合，而此时细胞已多值几千，此时转植基因在每个细胞内的整合情况不可能一致，所以第一代转基因鱼总是嵌合体。哺乳动物受精卵的单细胞期阶段较长，还有可能得到纯合体的转基因动物。

也可在囊胚期进行，得到的是嵌合体转基因动物

胚胎干细胞（EmbryonicStemCell，简称ES细胞）介导法

是将基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。因此，可以将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。即从早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系

其优点是：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一个特殊的基因型：用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。缺点就是许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因;

目前，胚胎于细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。Evans等（1981）用不同培养系统从小鼠囊胚的内细胞团分离并建立了多潜能干细胞克隆系；Stice和

Strelchenko等（1996）获得了牛的胚胎干细胞。

注意：DNA显微注射和胚胎显微注射的区别1胚胎显微注射得到嵌合体小鼠。

DNA显微注射得到转基因小鼠。

2胚胎显微注射是把是把转化/转导了目的基因的胚胎干注射到囊胚DNA显微注射是把DNA注射到原核期细胞

逆转录病毒载体法

将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。通过此方法，Slater等得到了转基因鸡，Haskell得到了转基因牛。

这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有一定的大小限度；所得转基因家畜的嵌合性很高，而需要广泛的杂交，以建立转基因系；转基因的表达问题尚未解决。

精子介导的基因转移

精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射方法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的1/10。其次，由于它不涉及对动物进行处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行实验，以保证每次实验都能够获得成功。

核移植转基因法

体细胞核移植是近年来新出现的一种转基因技术。该方法是先把外源基因