备课素材：PCR基因定点突变-2023——2024学年度第一学期高中生物学选择性必修三.pdf

PCR基因定点突变

PCR定点突变是最常用的基因定点突变技术，以PCR为基础的突

变方法优点很多，如突变效率高、可以任意定点诱变、快速简单等。

通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入

产物中。PCR定点突变技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突

变、材料和试剂容易获得、操作简单等优点，它又可以分为重叠延伸

PCR、大引物PCR等。

1.重叠延伸PCR

重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如下图所示，该

技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互

补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互

补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的

DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合

酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和

4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突

变是否成功。

重叠延伸PCR能将突变碱基加入至DNA的内部。但是这种方法往

往需要三轮PCR才能获得产物，过程繁琐。

例1.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶

基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是

（）

A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果

B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基

C.①过程需要先加热至90℃以上后再冷却至50℃左右

D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD

答案：D

2.大引物PCR

由于重叠延伸PCR需要三轮PCR才能获得大量突变DNA,多轮PCR

因引物的改变要将PCR产物进行试管的转移，而这种转移容易造成样

品遭受环境污染。有学者巧妙地设计出只需要两轮PCR即可获得突变

DNA的方法，即大引物PCR法。

大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是

突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所

示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不

完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中

的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整

的含有突变位点的DNA片段。

大引物PCR的巧妙之处在于摒弃了在突变碱基上下游分段、分别

PCR的思路，将第一轮PCR出的产物作为第二轮PCR的引物，直接获

得了突变DNA。但是这种方法依旧存在试管转移的问题。可以将第二

轮PCR中下游引物长度设计地比第一轮上游引物长一些，这样就可以

通过适当提高退火温度以抑制上游引物在第二轮中与模板链的结合。

例2.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功

能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行2轮PCR反应即可获得，第一

轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，

过程如图所示。请分析回答下列问题：

（1）引物结合到互补DNA链时的温度称退火温度，常规PCR设定的

退火温度通常是____。为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引

物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一

轮____，第二轮PCR仍需加入的引物是____。

答案：55-60℃高(另一种)健翼引物