ABI-3500xL基因分析仪操作流程.docxVIP

ABI-3500xL基因分析仪操作流程

对PCR产物的要求

纯度：OD260/OD280=1.6~2.0，用量：每反应10~100ng。强烈建议在测序前，先纯化PCR产物。

PCR产物的测序PCR反应

标准反应体系：

测序产物纯化：

方法同上。

上机测序

（一）启动系统

打开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。

打开3500xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。

启动电脑桌面Datacollectionsoftware。

检查维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击。

检查耗材状态：点击“Refresh”，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC、CBC和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。

仪器预热：点击仪表盘上的“StartPre-heat”按钮预热炉子和泳道。

（二）放置待测样品

1.检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好。

2.将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。

3.按仪器的TRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者。

（三）创建平板

1.点击CreatePlateFromTemplate，在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7，点击Open，输入详细的平板信息，包括Name,NumberofWells,PlateType,CapillaryLength,Polymer。一般详细如下。

点击屏幕下方的AssignPlateContents。

输入各个孔的样品名称等信息，Resultsgroup：输入结果的保存路径。

选中下面控制面板上Assay，Filenameconvention，Resultsgroup三个项目。

点击LinkPlateforRun→OK。

检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击StartRun，即启动运行。

（四）监控运行

仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。

可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看InstrumentRunViewsandFlags中各项：EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图。

可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。

启动、暂停或继续运行。

（五）查看结果

点击ReviewResults即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。

分析测序结果

打开软件：双击电脑桌面SequencingAnalysisv5.4图标。

导入结果：点击工具栏中Addsamples按钮，选择路径，导入待分析的测序结果。

分析：

Samplemanager中选择分析方法对测序结果进行分析。一般用BC(baseclling,将原始结果翻译为对应的碱基序列)。

选中BC复选框，点击工具栏中Startanalysis按钮，即开始分析。

分析结束后，结果将自动保存为ab1格式文件。

点击工具栏中Analysisreport按钮，可查看结果状态(BCstatus)，不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否。

选中某样品前show复选框，即可查看各样品的详细结果。

sequence显示碱基序列及其QV评分结果。

注意：

a.蓝色：HighQV=20+，结果可信；黄色MediumQV=15to19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色LowQV≤15，结果不可信。

b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。

Electropherogram显示电泳峰图及序列。

Raw显示看到原始电泳图。

打印：

Samplemanager中选中P(print)复选框，点击Startanalysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档。

操作注意事项

测序反应：

（1）模板：测序反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定。

（2）反应体系：一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时），一般8倍以内稀释比较可靠。

（3）反应条件：退火50℃和延伸60℃时，升降温速度需降低至1

（4）体系配制：反应体系的制备不能在样品制备区和PCR区进行，移液器不能混用，否则会造成实验室污染。

ABI3500xl日常维护

1.毛细管维护：

（1）每周查看阴极缓冲液的液面，避免毛细管露出液面干燥而失效。若液面下降，可在阴极缓冲液中加入双蒸水，保证毛细管插入液面下。下次电泳前换新的缓冲液。

（2）防止碰触毛细管针尖，只有在更换新的毛细管时才需打开检测窗口门，之后需在软