生物酶工程公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

Ch6生物酶工程生物酶工程（BiologicalEnzymeEngineering）：是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白催化特性或酶蛋白蛋白质特性等。本章主要简介核酶、进化酶、杂合酶和抗体酶相关基本概念和基本知识。第1页第1页

Ch6-1核酶(Ribozyme)到当前为止，除了我们传统概念酶——蛋白质外，还发觉另一类含有催化活性物质——核酸。这里核酶要和核酸酶（Nuclease）概念区分开来，前者是酶化学本质是核酸；后者是指催化核酸水解酶，其化学本质是蛋白质；1981年Cech等发觉四膜虫核糖体前体RNA能够在没有酶蛋白存在情况下，本身催化切除内涵子，完成加工过程；发觉了含有催化活性RNA，从而提出了核酶这个概念。因为核酶含有很多与酶蛋白截然不同特点，尤其在医学界优势更为突出，用于基因治疗能够克服一直困扰人们免疫问题。因此近些年来引发了酶工程研究领域极大热情。到当前为止，已经发觉天然核酶作用底物都是核酸，按其催化反应可分两类：剪切型核酶：这类核酶主要催化本身或异体RNA切割，相称于核酸内切酶作用。当前发觉剪切型核酶包括三种：①锤头型核酶R.Symons研究一些植物病毒RNA本身剪切功效后，提出了锤头状二级结构模型；②发卡型核酶发卡型核酶二级结构象一个发卡装，由50个碱基构成，它和底物14个碱基共同构成一个发卡结构，辨认顺序是NGUC，在N-G之间切割。③蛋白质－RNA复合酶由蛋白质和M1RNA两个部分构成，其中蛋白质分子量Da，RNA部分函377个碱基。催化活性完全有RNA部分完毕，蛋白质部分只是维护RNA构象，主要功效是剪切修饰tRNA。剪接型核酶：这类核酶主要催化mRNA前体修饰加工，切除内含子，并完毕片段拼接；主要包括组Ⅰ内含子和组Ⅱ内含子。Cech研究发觉四膜虫核糖体RNA前体，含有本身切除413碱基intron，并进行片段拼接功效，进一步研究发觉，其Intron本身含有催化RNA前体剪辑功效。脱氧核酶：前述核酶化学本质是RNA，在发觉RNA核酶后，不久就发觉了切割RNA和DNADNA核酶。1994年，Breaker利用体外选择技术，初次发觉了切割RNADNA分子，命名为脱氧核酶（DNAzyme）关于核酶应用前景关于核酶研究，主要目的是将其应用于基因治疗，总体上讲，当前处于研究阶段。开发公司治疗对象研究阶段AmericanCyanamidColumbiaUniversityGeneShearsInnovirOsakaUniversityRibozymePh.Inc.TokyoUniversityB细胞白血病-淋巴瘤人免疫缺点病毒Ⅰ人免疫缺点病毒Ⅰ乙肝病毒，丙肝病毒乙肝病毒，丙肝病毒丙肝病毒人免疫缺点病毒Ⅰ血管生长因子丙肝病毒临床前期临床前期一、二期临床临床前期临床前期临床前期一、二期临床临床前期临床前期关于核酶用于基因治疗研究存在主要问题①体内运送与细胞吸取及残留问题：②切割位点特异性选择问题：③本身稳定性问题：④毒性和免疫原性问题：第2页第2页

Ch6-2酶分子定向进化

（DirectedEvilution）酶分子定向进化是指在分子水平上，人为地创造特殊进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质酶蛋白。对酶蛋白分子改造，主要包括两个方面，即酶分子改造合理化设计（RationalDesign）和非合理设计（IrrationalDesign）合理化设计：主要指事先已经弄清楚了酶蛋白结构，有明确修饰目的，定点改造某一结构活某氨基酸而设计改造修饰方案，如酶蛋白化学修饰、酶蛋白基因定点突变等；非合理设计：事先不必拟定基因改造修饰目的，设计酶蛋白基因改造技术和办法，设计基因改造方案，然后按照预定目的要求，进行筛选。酶分子定向进化就属于非合理设计。1.酶分子定向进化办法：当前已经研究成功酶蛋白分子定向进化办法只要包括一下几种方面：易错PCR办法；DNA改组办法；基因家族之间同源重组办法；易错PCR法：易错PCR是在利用PCR（PolymeraseChainReaction）技术在Taq聚合酶催化下，对目的基因进行扩增，通过调整反应条件（提升Mg2＋浓度、加入Mn2＋改变反应体系中四种dNTP百分比浓度等），改变Taq酶催化目的基因扩增中突变频率，以一定频率随机构件了基因突变库，然后选择或筛选符合需要突变体。易错PCR关键在于一下两点控制：①每个目的基因突变碱基数要严格控制：突变率不应太高，太高时酶基