DB15T 3450—2024SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、品种和纯度技术规程.docx

ICS65.020.20CCSB05

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3450—2024

SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、品种和纯度技术规程

CodeofpracticeforidentificationofCyperusesculentusgermplasmresources,varietiesandpuritybySNPmarkermethod

2024-06-14发布2024-07-14实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、吉林省农业科学院（中国农业科技东北创新中心）。

本文件主要起草人：牛陆、杨向东、张立华、任伟、张原宇、侯智惠、马瑞、胡可欣、萨茹拉、路战远、韩淑娟、武玲鑫、张宇佳、李子南、韩畅、郭茄。

SNP标记法鉴定油莎豆种质资源、品种和纯度技术规程

1范围

本文件规定了利用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）标记进行油莎豆种质资源、品种及纯度鉴定的操作步骤要求。

本文件适用于油莎豆种质资源、品种及纯度的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

SNP标记singlenucleotidepolymorphismmarker单核苷酸多态性分子标记。

3.2

推荐引物recommendedprimer

种质资源和品种鉴定中优先选用的一套SNP引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。

3.3

品种纯度varietalpurity

品种在DNA分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的块茎数占供检样品块茎总数的百分率表示。

4操作步骤

4,1样品DNA提取

4.1.1样品准备

试验样品块茎的分样与保存，应符合GB/T3543.2的规定。

4.1.2用于种质资源和品种鉴定样品DNA提取

从样品中随机抽取10粒块茎发苗。分单株剪取0.1g幼苗叶片用液氮研磨成粉末。将研磨粉末转入2mL离心管，加入0.7mLCTAB提取缓冲液充分混匀。在55℃~65℃恒浴1h。加入0.7mL氯仿：异戊醇（24:1），上下轻摇5min。10000×g，室温下离心10min。取上清液，加入上清液三分之二体积预冷异丙醇，上下轻摇5min，-20℃冰箱放置30min。10000×g，4℃离心10min。沉淀用1mL75%的预冷乙醇洗一次。自然干燥后，用200μL1╳TE缓冲液溶解，置4℃保存。

注：以上为推荐用于种质资源和品种鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标准。

4.1.3用于纯度鉴定样品DNA提取

按照GB/T3543.4规定的方法，从送检样品中提取不少于100粒块茎发苗。提取方法同4.1.2。注：以上为推荐用于纯度鉴定的DNA提取方法，其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法都适用于本标准。

4.2PCR扩增

4.2.1引物筛选

用于油莎豆种质资源、品种及纯度鉴定的73组推荐引物及其序列，按照附录A执行。

4.2.2PCR反应

PCR反应在25μL的反应体系中进行。反应体系包括：2.5μL10×PCR缓冲液，0.5μL10mmol/LdNTPs,0.5μL5U/μLTaq酶，1.0μL50ng/μLDNA模板，1.0μL上下游引物混合物(引物浓度10umol/L)，19.5μLddH2O。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃10min。反应利用96孔PCR板在P