可逆的、平行的和多任务的克隆方法和试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN1703509A

(43)申请公布日2005.11.30

(21)申请号C3

(22)申请日2003.09.03

(71)申请人布鲁塞尔自由大学

地址比利时布鲁塞尔

(72)发明人C·兹皮尔M·C·米林科维奇P·加班特

(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所

代理人程泳

(51)Int.CI

C12N15/10

C12N15/65

C12N15/66

C12N15/70

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

可逆的、平行的和多任务的克隆方

法和试剂盒

(57)摘要

本发明涉及一种可逆的、平行的和/

或多任务的克隆方法和试剂盒，它们改进

了核酸构建体诸如载体或细胞染色体中的

遗传元件(优选多个)的克隆，也改进了在

体内或者体外快速、高效地选择正确整合

了所述遗传元件的所述构建体。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

Claim1.适用于至少一个靶核苷酸序列(A)的插入/缺失和倒位的遗传构建体(10)，

包含：

-启动子/激活子序列(11)，位于编码两种不同毒性分子的第一和第二核苷酸序列(1，

2)的上游，或者

-位于编码毒性分子的第一核苷酸序列(1)的上游的第一启动子/激活子序列(11)，和

位于相反方向的第二启动子/激活子序列(12)，其中所述第二启动子/激活子序列(12)

位于编码不同于所述第一毒性分子的第二毒性分子的解毒剂(2’)的第二核苷酸序列

的上游，或者

-启动子/激活子序列(11)，位于分别编码第一毒性分子和不同于所述第一毒性分子

的第二毒性分子的解毒剂的第一和第二核苷酸序列(1，2’)的上游。

Claim2.适用于至少一个靶核苷酸序列(A)倒位的依照权利要求1的遗传构建体

(10)，包含：

-第一启动子/激活子序列(11)，位于编码毒性分子的第一核苷酸序列(1)和编码不同

于所述第一毒性分子的第二毒性分子的解毒剂的第二核苷酸序列(2′)的上游，和

-位于第一启动子/激活子序列(II°表达方向的相反方向，优选在第二启动子/激活子

序列(12)的控制下，编码所述第一毒性分子的解毒剂的第三核苷酸序列(1′)。

Claim3.依照权利要求1或2的核酸构建体，其中编码毒性分子或者毒性分子的

解毒剂的每个核苷酸序列(1，2，1’，2’)是编码作为毒性分子或者所述毒性分子的

解毒剂的融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白由编码核苷酸序列构成，包括几个独

特的克隆位点以及编码针对细胞的毒性分子或毒性分子的解毒剂的核苷酸序列。

Claim4.依照前面任一权利要求的核酸构建体(10)，进一步包括位于编码毒性分子

的核苷酸序列(1，2)和/或编码毒性分子的解毒剂的核苷酸序列(1’，2’)的上游和下

游的重组位点。

Claim5.依照前面任一权利要求的核酸构建体(10)，其中编码毒性分子以及毒性分

子解毒剂的序列(1，2，1’，2’)是毒物/解毒剂序列，优选选自下列毒物/解毒剂系统：

CcdB/CcdA、Kid/Kis、Hok/Sok、Doc/Phd、RelE/RelB、PasA/PasB/PasC、

MazE/MazF、ParE/ParD。

Claim6.克隆载体，包含至少一个前面权利要求1至5中任何一项的核酸构建体

(10)。

Claim7.权利要求6的载体，进一步包含复制起点和选择标记，优选抗生素抗性

选择标记。

Claim8.被前面权利要求1至5中任何一项的核酸构建体或者前面权利要求6至7

中任何一项的载体转化或者含有整合于其染色体基因组上的至少一个依照前面权利

要求1至5中任何一项的核酸构建体的细胞。

Claim9.权利要求8的细胞，选自原核细胞