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非变性Ⅱ型胶原生产制备的纯化工艺

李洁;王玉梅

【摘要】背景:非变性胶原实验室层面的纯化已有许多文献和研究,但中试和生产量级的提取和纯化的报道和文献较少.这种实用技术毕竟要走出实验室才有意义,到中试和生产阶段更多面临的是成本、得率、设备、操作便利度的衡量.目的:探讨解决非变性Ⅱ型胶原中试及生产中脱盐、脱酸纯化的工艺方法及条件.方法:对统一制备的非变性Ⅱ型胶原分别按透析袋法、水洗法、甩滤法、中空纤维膜法4种方法进行纯化,通过得率、胶原含量、纯度3项指标对比4种方法在胶原纯化工艺的优缺点.结果与结论:①得率:透析袋法最高;中空纤维膜法其次;第三为甩滤法;水洗法最低;②胶原含量:透析袋法最高,中空纤维膜法其次,第三为水洗法,甩滤法最低;③胶原纯度鉴定:4种方法没有显著性区别;④压力对通量的影响:存在正相关,但差别并不大;⑤结果表明,通过得率、胶原含量、胶原纯度、压力差与膜通量数值关系等指标的比较,认为中空纤维膜法在非变性Ⅱ型胶原提纯中具有比较优势.该研究的技术路线已在2013年5月1日取得国家发明专利,专利号ZL201110065733.X,作者是该专利第一发明人.

【期刊名称】《中国组织工程研究》

【年(卷),期】2018(022)034

【总页数】5页(P5496-5500)

【关键词】Ⅱ型胶原;纯化;中空纤维膜;组织构建

【作者】李洁;王玉梅

【作者单位】北京康佳源生物技术有限公司,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,北京市102206;北京康佳源生物技术有限公司,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,北京市102206

【正文语种】中文

【中图分类】R318

文章快速阅读：

文题释义：胶原(collagen)：是一种不透明、白色、无支链的纤维蛋白质，是动物体内分布最广，含量最多的蛋白质。胶原的科学定义为：“细胞外基质(ECM)的结构蛋白质，分子中至少应该有一个结构域具有α链组成的三股螺旋构象”。通俗的概念：不溶于冷水、热水，有三螺旋结构，保留生物活性。胶原与胶原蛋白不是一种物质，胶原蛋白又称水解胶原蛋白，是胶原经过水解后失去了三螺旋结构的产物。

非变性Ⅱ型胶原：是胶原的一种类型，所谓非变性是指其三螺旋结构没有被破坏。Ⅱ型胶原软骨中较为多见，参与软骨的新陈代谢，与某些疾病的发生发展有关，如类风湿关节炎及骨关节炎。

0引言Introduction

胶原与胶原蛋白是不同的两种物质。实验室层面胶原的分离与纯化已有许多文献和研究，但胶原中试和生产量级提取和纯化的报道较少。具有三螺旋结构的称之为胶原，因保持了三螺旋结构，所以称之为非变性胶原，分子质量在104u以上；胶原在水解酶的作用下水解为小分子后，称其为胶原蛋白，或水解胶原蛋白，分子质量在1000-3000u[1-4]。

文章涉及的是从鸡软骨中提取的Ⅱ型胶原。鸡软骨中Ⅱ型胶原占软骨干质量的50%-60%，另有30%-40%是蛋白多糖[5-8]。Ⅱ型胶原有3条相同的α链，以三螺旋结构的方式构成[α1(Ⅱ)]3。软骨组织的胶原纤维呈现不溶解状态，形成一定形状的刚性骨架。透明质酸如同锁链将游离的蛋白多糖(PG)单体固定于胶原纤维骨架之上。由于蛋白多糖浓度很高，在胶原骨架之间形成了带有负电荷，水含性极强的黏稠胶体，使软骨坚硬而富于弹性，具有巨大的缓冲容量[2，9-12]。因为以上生理特性，Ⅱ型胶原的制备及利用越来越受到药品、生物材料、食品、保健品领域的关注。但是生产过程中胶原蛋白的纯化方法决定着纯度及得率，两者之于工业生产具有重要的意义，得率的多少决定着项目的可行性，也决定着成本的高低[13-14]。

目前针对非变性Ⅱ型胶原制备中纯化工艺文献及方法多是实验室层面的，样品量普遍较小，样品量多以克重计算，比如透析袋法，但此方法很难应用到实际生产中[15-21]。非变性Ⅱ型胶原制备液中成分包含了大分子杂质和小分子杂质以及色素，主要有杂蛋白，无机盐，酸根等，因此固液分离方法对纯化有一定的影响。传统的工业用固液分离方法有离心机离心、板框过滤、活性炭过滤、硅藻土吸附等，进行固相和液相分离[1，16-18]。这些方法操作强度大，操作繁琐，过滤精度较差，产品品质较差，更重要的是对本物料不太合适，得率与适用性差。

研究旨在解决批量生产前提下Ⅱ型胶原的纯化方法，投入原料量以kg计算[19-20]，实验中投入的提取后原料量为80kg。研究中试及生产条件下，Ⅱ型胶原制备中的纯化工艺，通过4种方法的比较，初步探索各种方法的优劣。

1材料和方法Materialsandmethods

1.1设计对比观察。

1.2时间及地点实验于2016年9至11月在北京通州开发区北京康佳源生物技术有限公司厂区完成。

1.3材料鸡软骨为华都肉鸡集团的冷冻鸡胸软骨，Ⅱ型胶原标准品为sigm