- 1、本文档共3页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
-
-PAGE1-
蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简易教程
一、相关仪器和试剂的准备:
(一)仪器:
1、垂直电泳仪(本体、干净玻璃板、制胶架、梳子等)。
2、移液器:1000μL、100μL、10μL各一支及枪头若干。
3、一只干净小烧杯和加热大烧杯。
4、可提供500V电压的电源。
5、用于染色和脱色的容器。
6、用于加热的电炉子
7、手套一副
8、微量进样器
(二)试剂:
1、二次蒸馏水。
2、30%丙烯酰胺混合溶液。
3、1.5mol/L的Tris(pH=8.8)和0.5mol/L的Tris(pH=6.8)。
4、10%的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液和10%的过硫酸铵溶液。
5、TEMED(四甲基乙二胺)标准品。
6、染色液、脱色液和电极缓冲液
7、蛋白Marker系列(Marker、Loadingbuffer,)二、样品制备
各取样品40μL于小离心管,加入10μL样品缓冲溶液,混匀。沸水中加热5min,待用。Marker取40μL,一起加热(可以用4次)
三、各溶液的配制
1、30%丙烯酰胺混合溶液。
29g丙烯酰胺,与1g甲叉双丙烯酰胺混合,定容到100mL,过滤。
2、10%SDS溶液
取5gSDS,用水溶解后,注入50mL容量瓶中,定容。(SDS为有机溶剂,在配制时易起泡沫,定容时应在泡沫全部退去后再定容,以免不准确)
3、10%过硫酸铵溶液
取5g过硫酸铵,用水溶解后,注入50mL容量瓶中,定容。
4、分离胶缓冲溶液
1.5mol/LpH=8.8的Tris-HCl缓冲溶液:将18.15gTris用98mL水溶解后,用浓盐酸调至pH为8.8,定容到100mL
5、浓缩胶缓冲溶液
0.5mol/LpH=6.8的Tris-HCl缓冲溶液:将6.0gTris用98mL水溶解后,用浓盐酸调至pH为6.8,定容到100mL
6、分离胶(12%)和积层胶(5%)的配制
分离胶
成分
体积(mL)
积层胶
成分
体积(mL)
水
4.9
水
5.5
30%丙烯酰胺混合液
6.0
30%丙烯酰胺混合液
1.3
1.5molL-1Tris(pH8.8)
3.8
0.5molL-1Tris(pH6.8)
1.0
10%SDS
0.15
10%SDS
0.08
10%过硫酸铵
0.15
10%过硫酸铵
0.08
TEMED
0.006
TEMED
0.008
7、电极缓冲液
将6gTris,28.8g甘氨酸和1gSDS加水溶解后,定容到1000mL,pH应为8.3。
8、考马斯亮蓝染色法溶液配制
染色液:称取0.25g考马斯亮蓝(G250),加入45mL甲醇、10mL冰醋酸和45mL
水,过滤后使用。
脱色液(新制):37.5mL冰醋酸、25mL甲醇加水到500mL。
9、银染法溶液配制
固定液:250mL甲醇,25mL冰醋酸,225mL水。
敏化液:0.02%的Na2S2O3.5H2O溶液。
显影液:0.04%甲醛溶在2%Na2CO3中。四、垂直电泳装置的组装及胶的灌制。
1、松开本体上的螺栓,拉开左右滑块,放入两块玻璃板组成凝胶室,低板的一块板向内
(注:做一块板也要加上另一块板)。合上滑块,拧螺栓锁死凝胶室。
2、将上述组合放入制胶架,插入并旋转凸轮固定。
3、灌入分离胶,至距离上沿3cm处。加入约1mm厚的一层水,放置至胶凝,约40min
左右。(胶要现灌现配,以免聚合)
4、分离胶凝固后,用滤纸吸干上层的水,配制积层胶,灌至上沿,插上木梳,放置约
2h,凝固。
五、加样品进行电泳
1、积层胶聚合完成后,小心拔下梳子,以去离子水洗涤
加样槽,除去未聚合的聚丙烯酰胺。松开凸轮,取出本体组合放入下槽,加入Tris-甘氨酸电极缓冲液,充满上下槽。
2、加样。用微量注射器按预定顺序加样,每个样品的上样10μL,每加完一个样品要在去离子水中洗涤注射器。
3、将电泳装置安装上盖与电源连接(正极应接下槽),开始电泳。在积层凝胶上加80-100V电压,待染料前沿进入分离胶后将电压提高到180-200V继续电泳,至溴酚蓝染料前沿到达分离胶的底部,关闭电源。(约2.5h)。
六、染色
(一)考马斯亮蓝染色
1、电泳结束后,取出凝胶室,用多用取胶器撬开玻板取出凝胶,放入容器中,加入染色液,染色1h。
2、将染色液倒入回收瓶中,以备下次使用,将脱色液倒入,浸泡脱色。一定时期(约
2h)最好更换脱色液一次,直至条带清晰。(约2天)
(二)硝酸银染色
蛋白质条带的银染是基于蛋白质中的各种基
文档评论(0)