（正式版）H-Y-T 0295-2020 海绵种属分子鉴定技术规程（正式版）.docxVIP

ICS07.060

A45

中华人民共和国海洋行业标准

HY/T0295—2020

海绵种属分子鉴定技术规程

Specificationofidentifyingspongebasedonmoleculardata

2020-06-28发布

2020-10-01实施

中华人民共和国自然资源部发布

I

HY/T0295—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国自然资源部提出。

本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。

本标准起草单位：大连海洋大学、中国科学院大连化学物理研究所、大连金普新区农业农村发展服务中心。

本标准主要起草人：付晚涛、曹旭鹏、杜萌萌、苏延明、王刚、吴孟嘉、张世杰、李东子、沈思思、丁小涵、王玄、肖一帆、王少杰、鲁艳莉、李晶莹。

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HY/T0295—2020

海绵种属分子鉴定技术规程

1范围

本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的原理与方法、海绵样品采集与保存。

本标准适用于海绵的样品采集、保存和分子生物学方法种属鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T12763.6—2007海洋调查规范第6部分：海洋生物资源调查

GB/T30744—2014深海微生物样品前处理技术规范

HY/T058—2010海洋调查观测监测档案业务规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

海绵sponge

目前已知仍然生存的最古老、最低等的多细胞动物，在动物界中单独构成多孔动物门。3.2

DNA条形码DNAbarcode

生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，用于快速准确识别、鉴定物种。

3.3

海绵条形码spongebarcode

海绵的保守基因序列信息的一种表述形式。

3.4

18SrRNA基因18SrRNAgene

编码18SrRNA基因的DNA序列。

3.5

细胞色素氧化酶亚基IcytochromeoxidasesubunitI

编码线粒体细胞色素氧化酶亚基I(CytochromeoxidasesubunitI)基因的DNA序列。

注：以下简称COI。

3.6

聚合酶链式反应polymerasechainreaction

DNA模板先经高温变性为单链，在适宜温度下和缓冲液中，两条引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和延伸，使位于两段引物序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。

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HY/T0295—2020

4原理

通过聚合酶链式反应(简称PCR)分别扩增海绵的18SrDNA和COIDNA的部分序列，测序获得各自序列信息后分别与已经鉴定的海绵18SrDNA和COIDNA序列比对，以此鉴定海绵种属。

5仪器与设备

5.1野外生物样品保存箱或保温箱。

5.2低温冰箱。

5.3研钵

5.5水浴锅。

5.6高速低温冷冻离心机。

5.7紫外分光光度计。

5.8聚合酶链式反应DNA扩增仪(简称PCR仪)。

5.9电泳仪。

5.10高压灭菌锅。

5.11酒精灯。

5.12液氮罐。

6试剂与材料

注：除非另有规定，使用试剂均为分析纯。

6.1无水乙醇。

6.270%乙醇。

6.3液氮。

6.4异丙醇。

6.5浓硝酸或浓盐酸。

6.6浓硫酸。

6.7蒸馏水或去离子水。

6.8蛋白酶K。

6.9Taq酶。

6.10琼脂糖。

6.11醋酸钾溶液(配方见附录A)。

6.12细胞裂解缓冲液(配方见附录A)。

6.13TE缓冲液(pH7.6)(配方见附录A)。

6.1410×PCR缓冲液(配方见附录A)。

6.15吸管。

6.16载玻片。

6.17采样袋或采样瓶。

6.18聚丙烯离心管。

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HY/T0295—2020

7海绵样品采集与保存

7.1海绵样品采集

首先，对于海绵及其周围环境，先拍照或摄像；此外，按照GB/T12763.6—2007中10.2规定