PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理.docx

PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及试验原理

【试验原理】

DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上肯定电压进展电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分别开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依靠的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。本试验承受TaKaRa公司的pMDTM18-TSimpleVector。这个载体以pUC19载体为根底，消退了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成〔见附录1〕。由于本载体上消退了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入适宜的酶切位点。

【试剂与器材】

〔一〕试剂

1.pMDTM18-TSimpleVectorKit〔Takara公司〕。2.TAE电泳缓冲液

3.琼脂糖〔Agarose〕

4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液，贮存于4℃。

2/9

5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

6.70%乙醇

7.胶回收试剂盒〔Omega公司〕

〔二〕器材

水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,凝胶成像系统或其它照相设备。

【操作方法】

〔一〕胶回收试剂盒回收PCR产物〔以Omega公司GelExtractionKit为例〕

当目的片段DNA完全分别时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。

凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积〔假设其密度为1g/ml〕。参加等体积的BindingBuffer

〔XP2〕，于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全溶化，每2-3min振荡混合物。〔在凝胶完全溶解之后，留意凝胶-Bindingbuffer混和物的pH值。假设其pH值大于8的话，DNA的产量将大大削减。假设是橙色或红色，则要参加5μl浓度为5M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。〕

取一个干净的HiBindDNAMini柱子装在一个干凈的2ml收集管内〔已备好〕。

将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000xg离心

1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。

假设DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可连续重3/9

复第5步至全部的溶液都经过柱子。每一个HibindDNA回收纯化柱都有一个极限为25μgDNA的吸附力量。假设预期产量较大，则把样品分别加到适宜数目的柱子中。

弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300μlBindingBuffer〔XP2〕至柱子中，室温下，10,000xg下离心1min。

弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700μlSPWWashbuffer〔已用无水乙醇稀释的〕至柱子中。室温下10,000xg离心1min。

〔浓缩的SPWWashBuffer在使用之前必需按标签的提示用乙醇稀释。假设DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下〕。

重复用700μlSPWWashbuffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。9.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000xg

离心2min以甩干柱子基质剩余的液体。

10.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，参加15~30μl〔具体取决于预期的终产物浓度〕的ElutionBuffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min,13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。假设再洗脱一次的话，可以把剩余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。

〔二〕连接反响〔以Takara公司pMDTM18-TSimpleVectorKit为例〕1〕在微量离心管中配制以下DNA溶液，全量为5