Pichia酵母表达系统使用心得.docx

Pichia酵母表达系统使认真得

摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。

甲基酵母局部优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有肯定的蛋白质翻译后加工，-+有利于真核蛋白的表达优点2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以到达++++每升数克表达产物的水平3.酵母培育、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，+++=远较真核系统简洁，格外适合大规模工业化生产。4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，局部甲醇酵母更可++++以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产本钱低生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简洁表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺当得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了局部用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简洁的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中

甲基酵母局部优点

与其他真核表达系统比较

与原核表达系统比较

1.属于真核表达系统，具有肯定的蛋白质翻译后加工，

-

+

有利于真核蛋白的表达优点

2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以到达

+++

+

每升数克表达产物的水平

3.酵母培育、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，

+++

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远较真核系统简洁，格外适合大规模工业化生产。

4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=

+

5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，局部甲醇酵母更可

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+

以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产本钱低

+表示优胜于；-表示不如；=表示差不多

EasySelectPichiaExpressionSystem

产品性能：

优点——使用简洁，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会消灭蛋白切割问题

全面产品报告及心得体会：

巴斯德毕赤酵母〔Pichiapastoris〕是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进展糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培育基中，便利蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点〔MCR〕3”端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5”端引入了alphafactor〔α-factor〕用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进展克隆的时候，假设你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG廉价。

第一步构建载体

XiangYang：pPICZ系列有很多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。

红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较简洁操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选〔PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝〕，而且对于大小适宜〔30—50KD〕的蛋白在产量上是pPIC9K无法比较的。

leslie：要做毕赤酵母表达试验，首先固然就要了解这个得意的酵母了〔椭圆形，肥嘟嘟的，格外得意，〕她和大肠杆菌长得有较大区分〔大肠杆菌是杆状的〕，因此在培育的过程中要区分这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应当都遇过这种状况吧，表达过程中染菌〔我们试验室曾经污染过各种颜色外形的细菌，那真是一段可怕的经受〕，假设在不知情的状况下连续做下去，那可以就是铺张大把的时间了。

根本生疏了毕赤酵母，了解了她生长的喜好〔多糖偏酸环境〕，生长的周期等等状况后，固然更多的精力还是应当花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐惧，有100KD，原来固然应当放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达〔其实后来觉察大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错〕和糖基化修饰〔主要是这个方面，因

为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰〕。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要格外留神，需要留意的是：

①酶切位点不能消灭在目的DNA片段中——假设片段长无法避开，可