PCR技术用于基因治疗及研究的进展.docx

分子生物学

课程论文

题目PCR技术用于基因治疗及争论的进展

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PCR技术用于基因治疗及争论的进展

摘要PCR技术与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的试验工作根底。PCR技术使微量的核酸〔DNA或RNA〕操作变得简洁易行，同时还可使核酸争论脱离活体生物。PCR技术的制造是分子生物学的一项革命，极大

地推动了分子生物学以及生物技术产业的进展。[1本]文在简述PCR技术原理的根底

上,综述了PCR在基因治疗和生物争论方面的概况。

关键词PCR技术聚合酶链式反响DNA体外扩增基因治疗

前言

1983年KaryMullis制造了一种特异性DNA体外扩增技术—聚合酶链式反响

〔polymerasechainreaction,PCR〕,是体外扩增DNA序列的技术.原来的PCR只能单纯扩增两端序列之间的DNA片段，现在可以扩增到序列两侧的未知序列，甚至可以扩增到序列未知的基因。PCR的模板也从原来要用的DNA进展到直接用RNA作为模板，即反转录PCR，这就使得从真核生物中扩增目的基因变得很简洁。PCR原本是一种定性的方法只能答复样品中有无目的基因存在，现在已经可以用来定量测定，即答复样品中原始模板的精准数目。PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来，省去了限制性内切酶消化和用连接酶连接的步骤，这就是所谓的克隆PCR。再加上PCR方法与其他方法联合应用，到目前为止已报道的PCR方法有几十多种之多。PCR技术建立以来，在20多年的时间里进展很快，已有一系列PCR方法被设计出来，并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学的争论中。PCR技术的消灭极大地推动了分子生物学的进展。[2]由于PCR技术的有用性和极强的生命力，PCR方法还将会被不断完善，进一步在生命科学争论中发挥更大的作用。

PCR技术的进展简史[3]

1953年沃森〔Watson〕与克里克〔Crick〕提出的DNA构造模型。

1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首 次证明白DNA

的半保存复制。

1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与适宜的引物杂交，用DNA聚合酶延长引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传争论室的Mullis等制造了具有划时代意义的聚合酶链反响。其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合

酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进展热变性时，会导致此酶钝化，每参加一次酶只能完成一个扩增反响周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进展PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需参加酶。1988年Saiki等从温泉中分别的一株水生嗜热杆菌thermusaquaticus中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反响后再加酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区分，将此酶命名为TaqDNA多聚酶TaqDNAPolymerase。此酶的觉察使PCR得以广泛应用。

20世纪90年月中期，随着多种自动化PCR扩增仪的问世，PCR技术快速普及，其应用范围也越来越广泛。近年来，PCR技术从原来的定性检测快速进展到实时定量检测，它抑制了传统PCR的很多缺乏，在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。

PCR技术原理及操作

PCR的根本原理是以拟扩增的DNA分子为模版，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，依据半保存复制的机制沿着模板链延长直至完的DNA合成，不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。由于合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长。

PCR是一种级联反复循环的DNA合成反响过程。PCR的根本反响由三个步骤组成：1变性，通过加热模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以